李慧等

[摘要]目的探討阿齊沙坦對轉(zhuǎn)化生長因子_β（TGF_β）誘導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖及遷移的影響。方法采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，取3～5代細(xì)胞用于實驗。用MTT法測定細(xì)胞增殖情況，用Boyden小室測試細(xì)胞遷移情況。采用10ng/ml TGF_β刺激VSMCs，并用阿齊沙坦干預(yù)，24h后用Western blot和RT_PCR檢測VSMCs中MMP_2、MMP_9及TIMP_1蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果TGF_β可促進(jìn)大鼠VSMCs的增殖及遷移，并增加大鼠VSMCs的MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)。阿齊沙坦則可抑制TGF_β誘導(dǎo)的大鼠VSMCs的增殖和遷移，并降低大鼠VSMCs的MMP_2、MMP_9及TIMP_1表達(dá)。結(jié)論阿齊沙坦可能通過下調(diào)MMP_2、MMP_9及TIMP_1的表達(dá)來抑制TGF_β誘導(dǎo)的自發(fā)性高血壓血管平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移。

[關(guān)鍵詞]MMP_2；MMP_9；TIMP_1；血管平滑肌細(xì)胞；增殖；遷移；阿齊沙坦

中圖分類號：R544.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1009_816X（2014）04_0274_04

[Abstract] Objective To investigate the effects of azilsartan on TGF_β_induced spontaneously hypertensive vascular smooth muscle cells （VSMCs） proliferation and migration. Methods Rat VSMCs were cultivated by the method of tissue explants adherence. Cells of generation 3 to 5 were used as the experimental system. The MTT test was used to measure cell proliferation and Boyden chamber assay was used to measure cell migration. Primary cultured VSMCs were treated by 10 ng/ml TGF_β and azilsartan for 24 hours. The expression of MMP_2， MMP_9， TIMP_1 were measured by Western blot and RT_PCR. Results The expression of MMP_2， MMP_9 and TIMP_1 in rat VSMCs stimulated by TGF_β increased significantly. VSMCs migration and proliferation also increased significantly. Azilsartan significantly inhibited TGF_β induced MMP_2， MMP_9 and TIMP_1 production in rat VSMCs， as well as VSMCs proliferation and migration. Conclusions Azilsartan inhibited TGF_β_induced VSMCs proliferation and migration by down_regulation the expression of MMP_2， MMP_9， TIMP_1.

[Key words] MMP_2； MMP_9； TIMP_1； Vascular smooth muscle cells ；Proliferation； Migration； Azilsartan

自發(fā)性高血壓是最常見的心血管疾病，以體循環(huán)動脈壓升高為主要特點。高血壓伴發(fā)的血管重構(gòu)包括血管壁腔比增加、小動脈稀少及血管功能異常?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是參與降解全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的蛋白酶家族，參與正常和病理條件下的組織重構(gòu)，金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）是MMPs的特異性抑制物[1]。MMPs/TIMP的動態(tài)改變，造成選擇性的降解ECM，從而調(diào)整血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、生長和成活[2]。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可能是通過抑制局部腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAS）活性和緩激肽的降解來抑制或逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)[3]。阿齊沙坦是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，多用于治療高血壓病[4]。但沙坦類藥物是否可抑制血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）中MMPs/TIMP的表達(dá)則鮮有報道。通過藥物抑制MMPs/TIMP活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，阻止血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移是防治高血壓發(fā)生、發(fā)展的一個可能的切入點。本研究觀察血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑阿齊沙坦對血管平滑肌細(xì)胞中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)的影響，探討轉(zhuǎn)化生長因子_β（TGF_β）在自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中誘導(dǎo)細(xì)胞外MMPs/TIMP分泌及促平滑肌細(xì)胞遷移、增殖能力，為臨床應(yīng)用阿齊沙坦治療高血壓提供指導(dǎo)信息。

1資料和方法

1.1材料：自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）和同一株系的正常血壓大鼠（WKY）大鼠（購自上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院高血壓研究所），雄性，7～10周齡。血壓：SHR>170mmHg（1mmHg=0.113kPa），WKY<100mmHg。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma，美國），酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio Tek，美國），流式細(xì)胞儀（BD，美國），Bio_Rad iQ5實時定量PCR儀、激光共聚焦顯微鏡（Lavision，德國），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Fermentas，加拿大），BCA蛋白濃度測定試劑盒、抗MMP_2多克隆抗體、抗MMP_9多克隆抗體、抗TIMP_1多克隆抗體（Santa Cruz，美國）DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT、DMSO、TBST緩沖液、碘化吡啶（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，北京），阿齊沙坦（武田制藥公司，日本）。

1.2實驗分組：將大鼠斷頭處死，無菌情況下分離胸主動脈，剪碎后加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法行原代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞長成致密單層后傳代，取3～5代細(xì)胞用于實驗。在傳代過程中，細(xì)胞以5×105個/ml接種于6孔板培養(yǎng)板上。實驗前48h換成不含血清的DMEM，使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。將培養(yǎng)的VSMC分成6組：WKY組、SHR組；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：10ng/ml TGF_β誘導(dǎo)增殖；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：50μmol/ml阿齊沙坦預(yù)處理30min后，用10ng/ml TGF_β誘導(dǎo)增殖。各組均應(yīng)用0.2%胎血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。

1.3MTT法檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖的作用：取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔3×104/孔均勻接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照上述分組方法將各組細(xì)胞懸液接種于96孔板上，培養(yǎng)24h后，結(jié)束實驗，將每孔的培養(yǎng)液吸出，重新加入180μl培養(yǎng)液，然后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT液20μl。在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸取培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200μl振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長測定各孔A值，取每組3孔的均值。

1.4Boyden趨化小室檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響：取對數(shù)生長期的VSMCs，將培養(yǎng)的VSMCs分成6組觀察VSMCs遷移：WKY組、SHR組：上室中加入未經(jīng)處理的VSMCs懸液，下室中加人DMEM；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：上室中加入未經(jīng)處理的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：上室中加入50μmol/ml阿齊沙坦孵育2h的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml。上、下室之間隔以8μm孔徑聚碳酸酯濾膜。將建立好的Boyden小室放入一容器培養(yǎng)24h后取出濾膜，固定、染色，在高倍鏡下（×400）隨機(jī)觀察6個視野，計數(shù)移行細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5Western blot檢測蛋白表達(dá)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌兩次后離心棄上清，加入含全酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取總蛋白。BCA法測定樣品蛋白濃度，完成十二磺基硫酸鈉/聚丙烯酸胺凝膠電泳和蛋白轉(zhuǎn)膜操作，膜片分別與一抗（抗MMP_2多克隆抗體、抗MMP_9多克隆抗體、抗TIMP_1多克隆抗體）進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，再與辣根酶標(biāo)記二抗反應(yīng)，經(jīng)適當(dāng)洗滌，膜片與ECL溫浴1min，保鮮膜包裹后，經(jīng)X光片曝光，顯影和定影，最后對結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析。

1.6RNA的提取及RT_PCR檢測m_RNA表達(dá)：以Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒要求操作。MMP_2上游引物序列：5_GCGACAAGAAGTATGGCTTC_3，下游引物序列：5_TGCCAAGGTCAATGTCAGGA_3；MMP_9上游引物序列：5_CGCAGACATCGTCATCCAGT_3，下游引物序列：5_GGATTGGCCTTGGAAGATGA_3；TIMP_1上游引物序列：5_CAATTCCGACCTCGTCATCA_3，下游引物序列：5_TCAGAGCCTTGGAGGAGCT_3，按實驗室常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl作為模板，加入2μl上游及下游引物和2μl Taq酶后用PCR儀擴(kuò)增。循環(huán)步驟如下：變性94℃ 1min，58℃ 1min和72℃ 1min共35個循環(huán)；末次長7min，終止反應(yīng)。以β_actin為內(nèi)參，依據(jù)2_ΔΔCT法計算各組細(xì)胞mRNA的相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理：以SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料用（x-±s）表達(dá)，組間比較采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測TGF_β對VSMCs細(xì)胞的增殖作用：見圖1。MTT法檢測結(jié)果如圖所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組細(xì)胞增殖水平均顯著高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組細(xì)胞增殖水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。另外，SHR組VSMCs細(xì)胞增殖水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY（#P<0.01）。

圖1各組大鼠VSMCs細(xì)胞增殖水平的比較

2.2阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響：見圖2。與WKY組相比，SHR組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多（#P<0.01），SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組細(xì)胞遷移數(shù)目高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（*P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組細(xì)胞遷移數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖2阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響2.3各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1蛋白水平比較：Western blot檢測結(jié)果如圖3所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組SHR大鼠VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY大鼠（P<0.05）。

圖3MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各組細(xì)胞中的蛋白的表達(dá)

2.4各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1 mRNA水平比較：RT_PCR檢測結(jié)果見圖4。SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1 mRNA表達(dá)水平均高于TGF_β+阿齊沙坦給藥組（*P<0.05）。各組SHR組VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY組（#P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。圖4MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各組細(xì)胞中mRNA的表達(dá)

3討論

自發(fā)性高血壓的主要病理生理變化是血管收縮與重塑，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡失衡是重要的原因之一[5]。各種致?lián)p傷原因引起的VSMCs異常增殖并且凋亡減少，造成血管管腔狹窄、閉塞、血管阻力增高、最終導(dǎo)致高血壓。阿齊沙坦在血管平滑肌和腎上腺等多種組織中，可通過選擇性阻斷血管緊張素Ⅱ與AT1受體的結(jié)合而阻斷血管緊張素Ⅱ的血管收縮和醛固酮分泌作用，故其作用不依賴于血管緊張素Ⅱ合成通路[6]。越來越多的研究表明MMPs的激活可能在VSMCs增殖過程中起重要作用。

1.2實驗分組：將大鼠斷頭處死，無菌情況下分離胸主動脈，剪碎后加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法行原代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞長成致密單層后傳代，取3～5代細(xì)胞用于實驗。在傳代過程中，細(xì)胞以5×105個/ml接種于6孔板培養(yǎng)板上。實驗前48h換成不含血清的DMEM，使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。將培養(yǎng)的VSMC分成6組：WKY組、SHR組；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：10ng/ml TGF_β誘導(dǎo)增殖；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：50μmol/ml阿齊沙坦預(yù)處理30min后，用10ng/ml TGF_β誘導(dǎo)增殖。各組均應(yīng)用0.2%胎血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。

1.3MTT法檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖的作用：取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔3×104/孔均勻接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照上述分組方法將各組細(xì)胞懸液接種于96孔板上，培養(yǎng)24h后，結(jié)束實驗，將每孔的培養(yǎng)液吸出，重新加入180μl培養(yǎng)液，然后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT液20μl。在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸取培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200μl振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長測定各孔A值，取每組3孔的均值。

1.4Boyden趨化小室檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響：取對數(shù)生長期的VSMCs，將培養(yǎng)的VSMCs分成6組觀察VSMCs遷移：WKY組、SHR組：上室中加入未經(jīng)處理的VSMCs懸液，下室中加人DMEM；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：上室中加入未經(jīng)處理的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：上室中加入50μmol/ml阿齊沙坦孵育2h的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml。上、下室之間隔以8μm孔徑聚碳酸酯濾膜。將建立好的Boyden小室放入一容器培養(yǎng)24h后取出濾膜，固定、染色，在高倍鏡下（×400）隨機(jī)觀察6個視野，計數(shù)移行細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5Western blot檢測蛋白表達(dá)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌兩次后離心棄上清，加入含全酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取總蛋白。BCA法測定樣品蛋白濃度，完成十二磺基硫酸鈉/聚丙烯酸胺凝膠電泳和蛋白轉(zhuǎn)膜操作，膜片分別與一抗（抗MMP_2多克隆抗體、抗MMP_9多克隆抗體、抗TIMP_1多克隆抗體）進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，再與辣根酶標(biāo)記二抗反應(yīng)，經(jīng)適當(dāng)洗滌，膜片與ECL溫浴1min，保鮮膜包裹后，經(jīng)X光片曝光，顯影和定影，最后對結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析。

1.6RNA的提取及RT_PCR檢測m_RNA表達(dá)：以Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒要求操作。MMP_2上游引物序列：5_GCGACAAGAAGTATGGCTTC_3，下游引物序列：5_TGCCAAGGTCAATGTCAGGA_3；MMP_9上游引物序列：5_CGCAGACATCGTCATCCAGT_3，下游引物序列：5_GGATTGGCCTTGGAAGATGA_3；TIMP_1上游引物序列：5_CAATTCCGACCTCGTCATCA_3，下游引物序列：5_TCAGAGCCTTGGAGGAGCT_3，按實驗室常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl作為模板，加入2μl上游及下游引物和2μl Taq酶后用PCR儀擴(kuò)增。循環(huán)步驟如下：變性94℃ 1min，58℃ 1min和72℃ 1min共35個循環(huán)；末次長7min，終止反應(yīng)。以β_actin為內(nèi)參，依據(jù)2_ΔΔCT法計算各組細(xì)胞mRNA的相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理：以SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料用（x-±s）表達(dá)，組間比較采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測TGF_β對VSMCs細(xì)胞的增殖作用：見圖1。MTT法檢測結(jié)果如圖所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組細(xì)胞增殖水平均顯著高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組細(xì)胞增殖水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。另外，SHR組VSMCs細(xì)胞增殖水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY（#P<0.01）。

圖1各組大鼠VSMCs細(xì)胞增殖水平的比較

2.2阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響：見圖2。與WKY組相比，SHR組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多（#P<0.01），SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組細(xì)胞遷移數(shù)目高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（*P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組細(xì)胞遷移數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖2阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響2.3各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1蛋白水平比較：Western blot檢測結(jié)果如圖3所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組SHR大鼠VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY大鼠（P<0.05）。

圖3MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各組細(xì)胞中的蛋白的表達(dá)

2.4各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1 mRNA水平比較：RT_PCR檢測結(jié)果見圖4。SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1 mRNA表達(dá)水平均高于TGF_β+阿齊沙坦給藥組（*P<0.05）。各組SHR組VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY組（#P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。圖4MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各組細(xì)胞中mRNA的表達(dá)

3討論

自發(fā)性高血壓的主要病理生理變化是血管收縮與重塑，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡失衡是重要的原因之一[5]。各種致?lián)p傷原因引起的VSMCs異常增殖并且凋亡減少，造成血管管腔狹窄、閉塞、血管阻力增高、最終導(dǎo)致高血壓。阿齊沙坦在血管平滑肌和腎上腺等多種組織中，可通過選擇性阻斷血管緊張素Ⅱ與AT1受體的結(jié)合而阻斷血管緊張素Ⅱ的血管收縮和醛固酮分泌作用，故其作用不依賴于血管緊張素Ⅱ合成通路[6]。越來越多的研究表明MMPs的激活可能在VSMCs增殖過程中起重要作用。

1.2實驗分組：將大鼠斷頭處死，無菌情況下分離胸主動脈，剪碎后加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法行原代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞長成致密單層后傳代，取3～5代細(xì)胞用于實驗。在傳代過程中，細(xì)胞以5×105個/ml接種于6孔板培養(yǎng)板上。實驗前48h換成不含血清的DMEM，使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。將培養(yǎng)的VSMC分成6組：WKY組、SHR組；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：10ng/ml TGF_β誘導(dǎo)增殖；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：50μmol/ml阿齊沙坦預(yù)處理30min后，用10ng/ml TGF_β誘導(dǎo)增殖。各組均應(yīng)用0.2%胎血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。

1.3MTT法檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖的作用：取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔3×104/孔均勻接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照上述分組方法將各組細(xì)胞懸液接種于96孔板上，培養(yǎng)24h后，結(jié)束實驗，將每孔的培養(yǎng)液吸出，重新加入180μl培養(yǎng)液，然后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT液20μl。在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸取培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200μl振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長測定各孔A值，取每組3孔的均值。

1.4Boyden趨化小室檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響：取對數(shù)生長期的VSMCs，將培養(yǎng)的VSMCs分成6組觀察VSMCs遷移：WKY組、SHR組：上室中加入未經(jīng)處理的VSMCs懸液，下室中加人DMEM；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：上室中加入未經(jīng)處理的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：上室中加入50μmol/ml阿齊沙坦孵育2h的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml。上、下室之間隔以8μm孔徑聚碳酸酯濾膜。將建立好的Boyden小室放入一容器培養(yǎng)24h后取出濾膜，固定、染色，在高倍鏡下（×400）隨機(jī)觀察6個視野，計數(shù)移行細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5Western blot檢測蛋白表達(dá)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌兩次后離心棄上清，加入含全酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取總蛋白。BCA法測定樣品蛋白濃度，完成十二磺基硫酸鈉/聚丙烯酸胺凝膠電泳和蛋白轉(zhuǎn)膜操作，膜片分別與一抗（抗MMP_2多克隆抗體、抗MMP_9多克隆抗體、抗TIMP_1多克隆抗體）進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，再與辣根酶標(biāo)記二抗反應(yīng)，經(jīng)適當(dāng)洗滌，膜片與ECL溫浴1min，保鮮膜包裹后，經(jīng)X光片曝光，顯影和定影，最后對結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析。

1.6RNA的提取及RT_PCR檢測m_RNA表達(dá)：以Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒要求操作。MMP_2上游引物序列：5_GCGACAAGAAGTATGGCTTC_3，下游引物序列：5_TGCCAAGGTCAATGTCAGGA_3；MMP_9上游引物序列：5_CGCAGACATCGTCATCCAGT_3，下游引物序列：5_GGATTGGCCTTGGAAGATGA_3；TIMP_1上游引物序列：5_CAATTCCGACCTCGTCATCA_3，下游引物序列：5_TCAGAGCCTTGGAGGAGCT_3，按實驗室常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl作為模板，加入2μl上游及下游引物和2μl Taq酶后用PCR儀擴(kuò)增。循環(huán)步驟如下：變性94℃ 1min，58℃ 1min和72℃ 1min共35個循環(huán)；末次長7min，終止反應(yīng)。以β_actin為內(nèi)參，依據(jù)2_ΔΔCT法計算各組細(xì)胞mRNA的相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理：以SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料用（x-±s）表達(dá)，組間比較采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測TGF_β對VSMCs細(xì)胞的增殖作用：見圖1。MTT法檢測結(jié)果如圖所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組細(xì)胞增殖水平均顯著高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組細(xì)胞增殖水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。另外，SHR組VSMCs細(xì)胞增殖水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY（#P<0.01）。

圖1各組大鼠VSMCs細(xì)胞增殖水平的比較

2.2阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響：見圖2。與WKY組相比，SHR組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多（#P<0.01），SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組細(xì)胞遷移數(shù)目高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（*P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組細(xì)胞遷移數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖2阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響2.3各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1蛋白水平比較：Western blot檢測結(jié)果如圖3所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組SHR大鼠VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY大鼠（P<0.05）。

圖3MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各組細(xì)胞中的蛋白的表達(dá)

2.4各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1 mRNA水平比較：RT_PCR檢測結(jié)果見圖4。SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1 mRNA表達(dá)水平均高于TGF_β+阿齊沙坦給藥組（*P<0.05）。各組SHR組VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY組（#P<0.05）。TGF_β+阿齊沙坦給藥組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。圖4MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各組細(xì)胞中mRNA的表達(dá)

3討論

自發(fā)性高血壓的主要病理生理變化是血管收縮與重塑，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡失衡是重要的原因之一[5]。各種致?lián)p傷原因引起的VSMCs異常增殖并且凋亡減少，造成血管管腔狹窄、閉塞、血管阻力增高、最終導(dǎo)致高血壓。阿齊沙坦在血管平滑肌和腎上腺等多種組織中，可通過選擇性阻斷血管緊張素Ⅱ與AT1受體的結(jié)合而阻斷血管緊張素Ⅱ的血管收縮和醛固酮分泌作用，故其作用不依賴于血管緊張素Ⅱ合成通路[6]。越來越多的研究表明MMPs的激活可能在VSMCs增殖過程中起重要作用。