★ 陳來 胡珺 李姍姍 張潔 徐彭 陳蘭英,3

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330006；2.南昌市洪都中醫(yī)院 江西 南昌 330000；3.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心 江西 南昌 330006)

黑色素瘤是一類因黑色素細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致的腫瘤，惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、致死率高。近幾年來的病例呈現(xiàn)增加趨勢[1,2]，然而，目前缺乏安全有效的治療藥物及方法[3]。龍葵(SolanumnigrumL.)全草均可入藥, 是一種藥食兩用的植物，分布廣，來源廣泛，加工方便[4,5]。本課題探討了龍葵提取物中澳洲茄堿對黑色素瘤的生長抑制效果并對其機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SHELLAB CO2培養(yǎng)箱，Leica倒置顯微鏡，EMax型酶標(biāo)儀(Molecular Device公司)，LightCycler?96 SW 1.1序列檢測系統(tǒng)(Roche)，島津UV-1700/2450紫外分光光度計(jì)。

1.2 材料 鏈霉素、青霉素、MTT粉末、DMSO、胰蛋白酶均購自Sigma公司; DMEM購自Hyclone公司;胎牛血清購自GIBCO公司；Trizol購自life technology公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKARA公司;SYBR綠色熒光定量PCR試劑盒、96孔PCR板均購自Roche公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自NORMAX公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 澳洲茄堿的提取與純化 澳洲茄堿的提取與純化方法參照文獻(xiàn)[6]所述，最終獲得HPLC級濃度為97.5%的澳洲茄堿粉末。稱取50mg用DMSO溶解成濃度為44.5mg/mL的均一溶液，置于4℃冰箱避光保存、備用。

2.2 MTT法檢測澳洲茄堿對小鼠黑色素瘤 B16細(xì)胞的抑制作用

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞株由南京大學(xué)模式動物研究所劉耕老師實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞以含10%FBS及1萬單位/mL雙抗的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)于0.5% CO2、37℃及90%左右濕度的CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞每三天按1∶3分盤傳代。

2.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 黑色素瘤B16細(xì)胞以10000個(gè)/孔鋪至96孔板內(nèi)，空白對照、加溶媒DMSO組(最高終濃度為0.18%)、加藥組(按10，20，40，60，80μg/mL，共5個(gè)梯度，溶媒DMSO最高終濃度為0.18%)各重復(fù)5個(gè)孔，共三板。以200μL DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h后，分別換成200μL空白、含溶媒或各濃度澳洲茄堿的DMEM全培養(yǎng)基， 24，48，72 h后各取一96空板，吸去培養(yǎng)基并加入200μL含5mg/mL MTT(溶于1×PBS并過濾)的新鮮DMEM全培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸去培養(yǎng)液，加入150μL DMSO搖床搖5 min，用酶標(biāo)儀振蕩20 s后測各孔492nm下的OD值。每板細(xì)胞中同一細(xì)胞的各濃度藥物的抑瘤率按下面公式計(jì)算：

細(xì)胞生長抑制率(%)=1-(OD藥物-OD空白)/(OD溶媒-OD空白)×100

結(jié)果匯總于圖1。從結(jié)果來看，澳洲茄堿對黑色素瘤B16細(xì)胞的抑制作用在處理后48 h基本上呈現(xiàn)與濃度成正比的趨勢，并可以容易得出黑色素瘤B16 細(xì)胞的48h IC50約為35μg/mL。

圖1 MTT法檢測澳洲茄堿對體外B16細(xì)胞的抑制作用

圖2 澳洲茄堿及其溶媒處理48 h后B16細(xì)胞中p53通路下游各基因表達(dá)情況比較(*P<0.05)

2.3 熒光定量PCR分析 B16細(xì)胞按3×105個(gè)/皿鋪到6孔板中，加藥組和對照組(即DMSO組，終濃度為0.09%)各至少重復(fù)3孔，細(xì)胞用DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換上含40μg/mL澳洲茄堿或等體積溶媒(DMSO)的DMEM全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞先用1×PBS洗兩次，再各皿加1mL Trizol反復(fù)吹打至細(xì)胞完全脫壁再靜置處理5分鐘以保證細(xì)胞的充分裂解，然后在液氮中速凍、保存。按Trizol的說明書進(jìn)行RNA的提取。各皿細(xì)胞總RNA經(jīng)測OD260/280和電泳比較光密度等方法定量后，取0.5μg用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒按試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄成總cDNA。每個(gè)10μL體系cDNA再用33μL miniQ稀釋，取1.4μL以10μL體系重復(fù)三次按Roche的SYBR熒光定量PCR試劑盒說明書配成反應(yīng)體系并在LightCycler?96 SW 1.1序列檢測系統(tǒng)(Roche)上進(jìn)行熒光定量PCR。檢測和比較了藥物處理組和對照組B16細(xì)胞中p53通路下游因子Puma，Bax和p21基因相對于β-actin的表達(dá)水平。所用引物序列為：β-actin：5'CTTCTGACCCATTCCCACCAT3'(f)，5'GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT3'(r)；Puma: 5'GCACCTAGTTGGGCTCCATTTCTG3'(f)，5'GTACGAGCGGCGGAGACAAG3'(r)；Bax：5' AGACAGGGGCCTTTTTGCTAC3' (f)，AATTCGCCGGAGACACTCG(r)；p21：5'AGGCAGCGTATATCAGGAG3' (f)，5'CCTGACAGATTTCTATCACTCCA3'(r)。熒光定量PCR的程序?yàn)?第一步:95℃ 600s；第二步：95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 10s，共45個(gè)循環(huán)；第三步：37℃ 30s。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和GraphPad軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，并且以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式展現(xiàn)。結(jié)果見圖2。

3 討論

本研究獲得的MTT數(shù)據(jù)顯示，澳洲茄堿相對溶媒DMSO的B16細(xì)胞生長抑制率呈劑量和時(shí)間依賴性。而從Q-PCR數(shù)據(jù)來看，終濃度為0.09%的DMSO處理48 h后的 Bax、p21表達(dá)水平皆較高，但從MTT數(shù)據(jù)來看相對而言并未造成對B16細(xì)胞的明顯抑制，提示該處理可能一定程度上激活了p53但并不足以顯著抑制B16細(xì)胞的生長,且其激活程度小于以等量DMSO為溶媒的澳洲茄堿(40μg/mL)處理相同時(shí)間的結(jié)果，而前者Puma的表達(dá)水平較低且不足后者一半，表明龍葵提取物澳洲茄堿能上調(diào)多種p53通路中下游因子基因的表達(dá)，其中對Puma基因表達(dá)增強(qiáng)明顯，提示澳洲茄堿能通過p53、Puma等促進(jìn)細(xì)胞凋亡而達(dá)到抑制黑色素瘤細(xì)胞生長的效果。本課題研究結(jié)果體現(xiàn)了龍葵提取物澳洲茄堿在治療黑色素瘤疾病的潛在開發(fā)價(jià)值。

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