徐麗華, 胡紹燕, 岑建農(nóng), 楊乃超, 洪 丹

(1. 蘇州大學附屬兒童醫(yī)院 血液腫瘤科, 江蘇 蘇州, 215003;2. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇省血液病研究所血液科, 江蘇 蘇州, 215006;3. 江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院 兒科, 江蘇 連云港, 222002)

兒童急性髓細胞白血病(AML)是兒童造血系統(tǒng)髓源細胞惡性增殖性疾病，作為一種高度異質性疾病，其發(fā)生和發(fā)展是一個多基因多步驟異常的過程[1]。盡管根據(jù)國際先進治療組的報道，其5年生存率已上升到了55%～65%[2], 但AML患兒的治療反應和預后受多種因素影響，誘導失敗和復發(fā)仍時有發(fā)生。傳統(tǒng)的用于判斷預后的細胞遺傳學存在一定的缺陷，探索新的分子遺傳學改變對預后的意義日趨重要。

微小RNA(以下簡稱microRNA /miRNA/miR)是一種內(nèi)源性的非編碼小分子RNA(長約22nt), 在轉錄后水平參與著人類約1/3基因的調控，影響著細胞的增殖、分化、凋亡，發(fā)揮著“促癌“或“抑癌”作用[3]。先前的諸多研究[4]已經(jīng)報道了miRNA表達失控與成人AML的關系，例如，miR-25的表達與成人AML的總體生存率(OS)顯著相關(P<0.05)。但迄今為止，對于miRNA在兒童AML中作用的研究尚不多。基于生物信息學分析結果，作者選擇了miR-196b、miR-25作為研究對象，利用熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法，檢測了這三種miRNA在兒童初診AML和非白血病對照組兒童之間的表達差異，并結合臨床資料分析其意義，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以本院2012年3月—2013年12月確診為AML的20例初診患兒作為研究對象，其中男5例，女15例，年齡12～157個月，中位年齡81.5個月。20例AML患兒診斷均經(jīng)臨床及血常規(guī)、骨髓象及免疫組織化學染色等實驗室檢查確診，部分患兒行染色體核型分析、29種融合基因篩查、AML突變組套檢測、FISH檢測，符合急性髓細胞白血病MIC (形態(tài)學細胞化學、免疫學、細胞遺傳學) 分型診斷依據(jù)。根據(jù)國際通用的FAB分類法進行亞型分類，20例AML患兒中M2、M3、M4、M5、M6分別為4例、1例、6例、8例和1例。所有初診AML患兒均采用2006年全國兒童AML化療方案[5]。同期納入20例非白血病兒童作為對照組。根據(jù)兒童急性髓細胞白血病診療建議[5], 進行危險度分組，低、中、高危組分別為5例、4例、11例。

1.2 方法

1.2.1 主要實驗設備與試劑: 人淋巴細胞分離液(Ficoll)(上海華精高科技生物有限公司); TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (美國ABI公司); TaqMan 2×Universal PCR Master Mix, 5 mL(美國ABI公司); TaqMan MicroRNA Assays(20×)(美國 ABI 公司)(探針引物序列由ABI公司設計合成，編號分別為: hsa-miR-196b: 002215-PN4427975; hsa-miR-25: 002442-PN4427975; U6snRNA: 001973-PN4427975); Thermo3.2全波長酶標儀; ABI 9700 PCR反應儀; ABI 7500熒光定量PCR儀等。

1.2.2 標本采集: 抽取初診時化療前實驗組與對照組兒童的骨髓2 mL, 肝素抗凝，標本采集后立即用Ficoll法分離骨髓單個核細胞，加Trizole充分裂解后，凍存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總RNA抽提、濃度測定及調整: Trizole法統(tǒng)一提取總RNA, 酶標儀測定RNA濃度并用DEPC水調整至4 ng/μL濃度，置于冰盒準備反轉錄。

1.2.4 miRNA反轉錄反應:按照美國ABI公司提供的TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit說明書操作步驟，應用ABI 9700PCR反應儀反轉錄分別合成2種miRNA的cDNA。逆轉錄參數(shù)條件設置: 16 ℃ 30 min, 42 ℃ 30 min, 85 ℃ 5 min, 4 ℃ forever, 共1個循環(huán)。

1.2.5 qRT-PCR分析:上述反轉錄產(chǎn)物先用管家基因ABL進行熒光定量PCR反應(設定標準曲線)，以驗證RNA抽提及反轉錄產(chǎn)品質量，ABL定量結果顯示均在104拷貝數(shù)以上，提示標本及產(chǎn)品質量良好；然后進行miR-196b、miR-25, 和內(nèi)參U6的莖環(huán)qRT-PCR檢測。設置反應條件：50 ℃ 2 min滅活UNG酶, 95 ℃10 min預變性, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 共40個循環(huán)。每個標本采用三復孔。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗中每個標本設三個復孔，結果分析時，要求同一標本復孔Ct值相差≤0.5，內(nèi)參U6的Ct值≤25, 否則棄去；擴增曲線結果分析設定手動Ct閾值為0.08; 以U6 snRNA為內(nèi)參基因, miR-196b、miR-25的相對表達量以公式2-△△Ct表示(計算△△Ct時，對照組△Ct取其中位數(shù))。得到的基因表達數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學檢驗為非正態(tài)分布的定量資料，故采用SPSS 18.0軟件進行非參數(shù)檢驗統(tǒng)計處理，兩獨立樣本秩和檢驗用于兩組獨立樣本之間差異的比較，多重獨立樣本之間的比較采用K個獨立樣本秩和檢驗，雙變量相關分析用于比較兩組定量資料之間的相關性。結果分別以秩均值或中位數(shù)表示，同時采用GraphPad Prism 5軟件進行繪圖。以P<0.05 判定為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miRNA表達水平在AML患兒和對照組間的比較

在骨髓單個核細胞中，2種miRNA的表達水平見表1。miR-196b的相對表達量在患者和對照組間有顯著差異(P=0.017)，AML患兒的miR-196b表達水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05), miR-25似乎在患者組降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.245)。見圖1。

表1 AML患兒與對照組兒童兩種miRNA的表達水平比較(中位數(shù)M)

圖1 miR-196b、miR-25在病人組和對照組間的相對表達對比

2.2 miRNA表達水平與臨床資料之間的關系

2.2.1 miRNA表達水平與危險度分組的關系: 在危險度分組的兩兩比較中, miR-196b在高危組、中危組和低危組之間的秩均值分別為13.40、8.25、4.60, 表達水平有顯著差異(χ2=8.642,P=0.013), 高危組miR-196b表達水平最高，低危組最低。miR-25在不同危險度分組之間無顯著差異(P=0.129)。見圖2。

2.2.2 miRNA表達水平與治療反應(一療程是否緩解)的關系:以d26骨髓幼稚細胞比例<5%為一療程緩解組，≥5%為一療程未緩解組, miR-25表達水平的秩均值分別為9.80和4.40，兩組間有顯著差異(Z=-2.205,P=0.027)，在一療程緩解組miR-25的表達水平顯著增高。而miR-196b的表達水平在2組間無顯著差異(P=0.205)。

2.2.3 miRNA表達水平與初診白細胞分組的關系：在WBC<10萬/mm3和WBC≥10萬/mm3兩組間, miR-196b表達水平的秩均值分別為8.00和14.33, 2組間有顯著差異(Z=-2.280,P=0.023), 在WBC≥10萬/mm3組miR-196b的表達水平較高。而miR-25的表達水平在2組間無顯著差異(P=0.101)。

2.2.4 miRNA表達水平與初診LDH的關系以及初診白細胞計數(shù)之間的關系: miR-25相對表達量與初診LDH數(shù)值之間呈負相關(r=-0.511,P=0.021), 隨著LDH水平的增高, miR-25表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而在miR-196b的表達水平與初診時LDH數(shù)值無顯著相關(P>0.05); 血清LDH濃度與初診白細胞計數(shù)呈正相關(Spearman相關系數(shù)r=0.0.851，P<0.001)。兩個miRNA的表達水平與初診白細胞計數(shù)無明顯相關性(P>0.05)。

2.2.5 miRNA表達水平與細胞遺傳學特點的關系:在染色體核型預后良好組和預后不良組間, miR-196b表達水平的秩均值分別為4.33和8.67, 具有顯著差異(Z=-2.082,P=0.037), 提示預后不良組miR-196b表達水平增高；而miR-25表達水平的秩均值分別為9.14和4.50, 差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.143,P=0.032)；在預后不良核型組呈低表達現(xiàn)象。

2.2.6 miRNA表達水平與AML患兒其他臨床資料之間的關系:miR-196b、miR-25的表達水平在不同性別分組間無顯著差異(P>0.05)，與年齡、WBC計數(shù)、幼稚細胞、CRP、FAB分型等初診時臨床資料無明顯相關性(P>0.05)。

3 討 論

自1993年Lee等[6]首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來，這種長度序列高度保守的小分子從此開啟了生物學界研究的新領域。通過調控不同的下游靶基因[7], miRNA不僅參與白血病的形成，而且影響其治療反應和預后。本研究中，作者利用qRT-PCR方法分析后發(fā)現(xiàn)，相對于對照組來說，初診AML患兒的miR-196b具有明顯高表達現(xiàn)象，而miR-25表達水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

miR-196b定位于HOX基因簇，在兒童ALL中與HOX基因表達量呈正相關性[8], 其功能主要是提高造血祖細胞的存活和增殖能力[9], 在MLL重排和NPM1突變陽性的兒童AML中，miR-196b表達增加[10]。高表達的miR-196b與成人AML不良預后相關[4]。本研究結果顯示，在不同的危險度分組之間，miR-196b的表達水平具有顯著差異，尤其在高危組和低危組之間差異明顯(P=0.013), 與上述報道相符。在比較染色體核型不良組和核型良好組以及WBC<10萬/mm3和WBC≥10萬/mm3組之間的表達水平后發(fā)現(xiàn)，miR-196b在核型不良組和WBC≥10萬/mm3組表達水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.037和0.023)。眾所周知，細胞遺傳學異常是一個經(jīng)典的預后相關因素，而初診時WBC≥10萬/ mm3是評估AML患兒危險度的高危因素之一。由此可見，miR-196b是一種與危險度和預后密切相關的小分子RNA。至于miR-196b在兒童AML的生物學進程中是如何發(fā)揮作用的，作者尚不清楚。近期兩個有關AML的體外研究已經(jīng)證實了miR-196b的外源性高表達可以導致髓系分化部分受阻和髓系造血祖細胞增殖上調[11-12]。

迄今為止，關于miR-25的研究相對較少，現(xiàn)有的研究大多集中于實體瘤方面。例如在結直腸癌中，miR-25是一個特異敏感的預后標記物[13]，而在胃癌患者的血漿中miR-25明顯增高，是早期胃癌診斷的一種非侵入性標記物[14]。本研究中，與對照組相比, miR-25在AML患兒中未發(fā)現(xiàn)明顯差異表達，但結合臨床資料分析后發(fā)現(xiàn)，miR-25表達水平在誘導一療程緩解組和未緩解組之間以及染色體核型良好組和不良組之間具有顯著差異(P=0.027, 0.032)[15]。目前，AML患兒早期治療反應備受重視，誘導一療程緩解情況，已被公認能夠預測病人的預后和轉歸，miR-25在一療程緩解組和染色體核型良好組的高表達現(xiàn)象提示miR-25與AML患兒的預后相關[16]，高表達miR-25的患兒對誘導治療敏感，可能與良好預后相關；在對20例AML患兒的臨床資料進行回顧性分析后，作者還發(fā)現(xiàn)，初診血清LDH濃度與初診白細胞計數(shù)呈正相關(r=0.851,P<0.001), 而初診miR-25表達水平與初診LDH呈負相關(r=0.511,P=0.021)[17]。眾所周知，初診時高白細胞的患兒預后較差，而LDH在一定程度上代表著體內(nèi)腫瘤負荷，這也提示miR-25與預后的相關性，在兒童AML的生物學進程中，miR-25可能發(fā)揮著潛在的抑癌活性或協(xié)同抑癌作用，影響著治療反應及預后，其機制有待于進一步的研究[18]。

總之，通過莖環(huán)qRT-PCR方法，我們初步研究了miR-196b、miR-25在兒童初診AML中的表達及意義，證實了在兒童初診AML中miR-196b的差異表達現(xiàn)象及其與預后的相關性，與成人AML的研究結果不盡相同，也許在兒童AML中miRNA有著不同的生物學特性，下一步作者將擴大樣本量進一步深入研究。未來有必要在這些miRNAs參與兒童AML生物學進程的機制方面進行全方位的研究。不遠的將來，這些表達失控的miRNAs不僅可能成為強有力的早期診斷和評估預后的生物學標記物，按照Garzon R等設想的思路[19]，或許還將成為兒童AML治療的新靶點新方向。

[1] Manola K N. Cytogenetics of pediatric acute myeloid leukemia[J]. Eur J Haematol, 2009, 83(5): 391.

[2] Harrison C J, H ills R K, Moorman A V, et al. Cytogenetics of Childhood Acute Myeloid Leukemia: United Kingdom Medical Research Council Treatment Trials AML 10 and 12[J]. J Clin Oncol, 2010, 28(16): 2674.

[3] Chen C Z. MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J]. N Engl J Med, 2005, 353(17): 1768.

[4] Wang Y, Li Z, He C, et al. MicroRNAs expression signatures are associated with lineage and survival in acute leukemias [J]. Blood Cells Mol Dis, 2010, 44(3): 191.

[5] 中華醫(yī)學會兒科學分會血液學組, 《中華兒科雜志》編輯委員會. 兒童急性髓細胞白血病診療建議[J]. 中華兒科雜志, 2006, 44(11): 877.

[6] Lee R C, Feinbaum R L, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5): 843.

[7] Dong C, Ji M, Ji C. microRNAs and their potential target genes in leukemia pathogenesis[J]. Cancer Biol Ther, 2009, 8(3): 200.

[8] Schotte D, Lange-Turenhout E A, Stumpel D J, et al. Expression of miR-196b is not exclusively MLL-driven but is especially linked to activation of HOXA genes in pediatric acute lymphoblastic leukemia[J]. Haematologica, 2010, 95(10): 1675.

[9] Dixon-McIver A, East P, Mein C A, et al. Distinctive patterns of microRNA expression associated with karyotype in acute myeloid leukaemia[J]. PLoS ONE, 2008, 3(5): e2141.

[10] Danen-van Oorschot A.A, Kuipers J E, Arentsen-Peters S, et al. Differentially expressed miRNAs in cytogenetic and molecular subtypes of pediatric acute myeloid leukemia [J]. Pediatr Blood Cancer, 2012, 58(5): 715.

[11] Popovic R, Riesbeck L E, Velu C S, et al. Regulation of miR-196b by MLL and its overexpression by MLL fusions contributes to immortalization [J]. Blood, 2009, 113(14): 3314.

[12] Velu C S, Baktula A M, Grimes H L. Gfi1 regulates miR-21 and miR-196b to control myelopoiesis[J]. Blood, 2009, 113(19): 4720.

[13] Xiaojun L i, Chunyan Yang, Xiaoqiang Wang, et al. The expression of miR-25 is increased in colorectal cancer and is associated with patient prognosis[J]. Med Oncol, 2013, 30(1): 781.

[14] C Zhu, C Ren, J Han, et al. A five-microRNA panel in plasma was identified as potential biomarker for early detection of gastric cancer[J]. British Journal of Cancer, 2014, 110(9): 2291.

[15] 車琳,許云云,龐麗,等.核因子陽性兒童急性髓細胞性白血病臨床特征及預后因素分析[J].中華實用兒科臨床雜志,2014,29(3):207.

[16] 陳貴杰,鐘東,唐文淵,等.急性髓細胞性白血病M2型(緩解期)合并小腦出血1例[J].第三軍醫(yī)大學學報,2013,35(16):1755.

[17] 宋軍,朱紅倩,郭鵬翔,等.胎盤多肽與rhG-CSF治療急性髓細胞性白血病療效觀察[J].中華全科醫(yī)學,2013,11(10):1569.

[18] 余杏,盧孝東,王永卿,等.急性白血病患者血清中LDH和HBDH水平檢測的臨床意義[J].吉林大學學報：醫(yī)學版,2012,38(5):942.

[19] Garzon R, Marcucci G, Croce C M. Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges[J]. Nat Rev Drug Discov, 2010, 9(10): 775.