徐修才，伍 權(quán)，鄭 南，丁凱陽，劉 欣

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院 1.中心實(shí)驗(yàn)室；2.血液科，安徽 合肥230001)

以腫瘤基因?qū)W為基礎(chǔ)的骨髓增值性疾病(MPD)鑒別診斷，主要是通過檢測BCR-ABL融合基因及JAK2基因突變完成,BCR-ABL陽性者被診斷為慢性髓細(xì)胞白血病(CML),陰性者考慮CML以外的MPD，后者常見的為真性紅細(xì)胞增多癥(PV),原發(fā)性血小板增多癥(ET)以及原發(fā)性骨髓纖維化(IMF)。目前，國內(nèi)外大多采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(AS-PCR)檢測V617F突變，但是MPD患者中還可出現(xiàn)其他突變，特別是PV患者。JAK2 V617F以外的突變主要發(fā)生于第12外顯子，因此對MPD患者同時(shí)進(jìn)行JAK2 V617F和JAK2 exon12突變檢測是非常需要的。本研究建立一種多重位點(diǎn)特異性PCR篩選方法并探討其在骨髓增殖性疾病中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1研究對象所有病例來自2011年12月至2012年11月間在我院住院和門診隨訪的BCR-ABL 陰性的MPD患者149例為研究組，其中男78 例，女71例，年齡21-86歲，平均(54.5±10.1)歲，包括PV 73例，ET 51例，IMF 25例。對照組35 例，其中急性白血病20 例，男11例，女9例，年齡19-78歲，平均(53.0±11.5)歲;健康對照15例，男8 例，女7例，年齡21-62 歲，平均(33.2±8.5)歲。所有患者均經(jīng)過我院常規(guī)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)、免疫表型、融合基因、染色體、骨髓病理檢查等確診，符合相應(yīng)疾病的2008年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1 基因組DNA提取 取200 μl患者骨髓或外周血及健康志愿者外周血標(biāo)本，應(yīng)用Karroten 血液基因組DNA 提取試劑盒(快速型)提取DNA，具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。所有DNA樣品經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測以確定質(zhì)量良好后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多重位點(diǎn)特異性PCR檢測 PCR引物分別根據(jù)5種突變型基因序列設(shè)計(jì)(見表1)。PCR反應(yīng)使用的Taq酶和10×PCR buffer等購買自MBI公司。PCR反應(yīng)體系總體積25μl，包括1×PCR buffer、MgCl21.5 mmol/L、dNTP 200μmol/L、8條引物各200 μmol/L、Taq酶1.5U、基因組DNA 50 ng。PCR反應(yīng)在Biometra Tgradient型PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性8 min,循環(huán)中95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 1 min，共循環(huán)40次；循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳條帶大小判斷標(biāo)本中有無JAK2基因突變和突變類型。JAK2突變陽性的標(biāo)本，分別選擇4例，送上海生物工程公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料采行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1凝膠電泳分析多重AS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物149例MPD患者中共檢出118例患者存在JAK2突變，其中PV患者陽性68例，ET患者陽性35例，IMF患者陽性15例(見表2，圖1)。20例白血病患者和15例健康對照者中均未檢出JAK2基因突變。

2.2基因測序驗(yàn)證突變陽性結(jié)果

將所有JAK2 exon12突變陽性和3例JAK2 V617F突變陽性的MPD患者標(biāo)本送測序。測序結(jié)果顯示，第254堿基處JAK2 V617F突變陽性樣本為G/T重疊峰(雜合突變，圖2A);4例通過本方法檢測為K539L突變的標(biāo)本經(jīng)基因測序分析，1例為H538Q合并K539L復(fù)合突變(圖2B)，另3例檢測為K539L突變(圖2C)。

表1 多重AS-PCR 篩選JAK2突變所用引物序列

M:DNA 分子量Marker;1:空白對照;2:陰性標(biāo)本;3,4:K539L突變5:V617F突變;6:陰性對照

圖1多重位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增JAK2基因突變電泳圖

2.3外周血細(xì)胞的分析

我們對于149例病例(包括PV、ET、IMF 3組)的外周血計(jì)數(shù)進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)突變型的白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血紅蛋白計(jì)數(shù)較野生型高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0．05)。而對于血小板計(jì)數(shù)，突變型也較野生型高，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

圖2 JAK2突變測序圖

病種總例數(shù)野生型例數(shù)突變性例數(shù)突變率PV7356893.2%ET51163568.6%IMF25101560%合計(jì)1493111879.2%

表3 JAK2突變與血液學(xué)特征之間的關(guān)系

**P≤0.0005；*P≤0.0001 compared with the wild type of the same MPD

3 討論

2005年Baxter等多個(gè)研究組[1，2]報(bào)道了MPD患者存在高致病性的獲得性基因突變：JAK2V617F突變，在JAK2基因的第1849位密碼子由G變成T后，JAK2激酶的第617處纈氨酸(V)被苯丙氨酸(F)取代(JAK2V617F)。后續(xù)的研究又發(fā)現(xiàn)在部分JAK2V617F陰性的MPD患者中可檢測到JAK2 exon12突變或其他突變，尤其在多數(shù)JAK2V617F陰性的PV患者中可檢測到JAK2 exon12突變。JAK2基因突變的發(fā)現(xiàn)改變了MPD的分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)，WHO 2008年修訂的MPD診斷標(biāo)準(zhǔn)中已把JAK2V617F突變列為首選檢測項(xiàng)目，對JAK2V617F突變陰性但仍疑診PV的患者應(yīng)考慮有無JAK2基因其他突變的可能[3]。JAK2V617F以外的突變主要發(fā)生于exon12，因此運(yùn)用在臨床上簡便易行的方法對MPD患者進(jìn)行JAK2V617F和JAK2exon12突變檢測是必要的[4]。

由于使用的檢測方法不同，JAK2V617F突變在PV、ET和IMF中陽性率分別達(dá)65%～97%、23%～57%和35%～57%[5-7]。在JAK2V617F陰性的MPD患者中5%～40%可檢測到JAK2exon12突變，主要出現(xiàn)于PV患者中[8]。本實(shí)驗(yàn)中，PV中陽性率為93.2%；ET中陽性率為68.6%；IMF中陽性率為60%；和國內(nèi)外運(yùn)用AS-PCR檢測JAK2V617F的文獻(xiàn)報(bào)道的突變率相比，陽性率有所提高[9，10]。149例MPD患者中檢測出4例 exon12突變，均經(jīng)過測序證實(shí)，其中3例為PV患者，1例ET患者。在本項(xiàng)研究中，JAK2突變陽性的3種MPD患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)，PV患者的血小板計(jì)數(shù)及ET患者的血紅蛋白，突變型較其野生型高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果和最近國內(nèi)外的研究報(bào)道基本一致[11，12]。我們在ET患者中也檢測出exon12突變，這表明V617F以外的突變也可能發(fā)生在除PV以外的MPD患者中。由于發(fā)現(xiàn)的陽性病例較少，JAK2 exon12突變陽性患者的臨床和血象特征與JAK2V617突變陽性者是否有差異仍有待積累病例進(jìn)一步研究。

我們采用外周血單個(gè)核細(xì)胞提取基因組DNA為檢測樣本，通過多重PCR，對149例MPD臨床標(biāo)本具有較高的陽性檢出率；而對15例健康正常人和20例急性白血病患者進(jìn)行檢測，均沒有發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。研究結(jié)果表明BCR/ABL陰性的MPD中JAK2的陽性率與其他血液惡性疾病有顯著性差異，JAK2可以作為篩查BCR/ABL陰性的MPD的一項(xiàng)重要指標(biāo)。多重等位基因特異性PCR具有很好的特異性和準(zhǔn)確性，能有效提高突變檢出率，簡單易行，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]Baxter EJ，Scott LM，Campbell PJ，et al.Acquired mutation of the tyrosine kinaseJAK2 in human myeloproliferative disorders[J].Lancet,2005,365:1054.

[2]Levine RL，Wadleigh M，Cools J，et al.Activating mutation in the tyrosine kinaseJAK2 in polycythemia vera,essential thrombocythemia,and myeloid metaplasia with myelofibrosis[J].Cancer Cell,2005,7:387.

[3]Tefferi A，and Vardiman JW.Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms:the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms[J].Leukemia,2008,22:14.

[4]Ormazabal C，Hurtado C，Aranaz P，et al.Low frequency ofJAK2 exon 12 mutations in classic and atypical CMPDs[J].Leuk Res,2008,32:1485.

[5]Lippert E，Boissinot M，Kralovics R，et al.TheJAK2-V617F mutation is frequently present at diagnosis in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera[J].Blood,2006,108:1865.

[6]Levine RL，Belisle C，Wadleigh M，et al.X-inactivation-based clonality analysis and quantitativeJAK2V617F assessment reveal a strong association between clonality andJAK2V617F in PV but not ET/MMM,and identifies a subset ofJAK2V617F-negative ET and MMM patients with clonal hematopoiesis[J].Blood,2006,107:4139.

[7]費(fèi)海榮，張 日，陳蘇寧,等.骨髓增殖性疾病137例患者JAK2基因突變的研究[J].中華內(nèi)科雜志,2007,46:271.

[8]Williams DM，Kim AH，Rogers O，et al.Phenotypic variations and new mutations inJAK2 V617F-negative polycythemia vera,erythrocytosis,and idiopathic myelofibrosis[J].Exp Hematol,2007,35:1641.

[9]梅麗娜,王季石,盧英豪,等.141例慢性骨髓增生性疾病中JAK2基因V617F點(diǎn)突變的研究[J].臨床血液學(xué)雜志,2009,22:244.

[10]Sazawal S，Bajaj J，Chikkara S，et al.Prevalence ofJAK2 V617F mutation in Indian patients with chronic myeloproliferative disorders[J].Indian J Med Res,2010,132:423.

[11]Campbell PJ，Griesshammer M，Dohner K，et al.V617F mutation inJAK2 is associated with poorer survival in idiopathic myelofibrosis[J].Blood,2006,107:2098.

[12]王冬梅，郭慧梅，正菊榮,等.JAK2V617F點(diǎn)突變與BCR-ABL陰性骨髓增殖性疾病臨床關(guān)系研究[J].臨床薈萃,2008,23:317.