靳松 彭建強(qiáng) 林昆 黃愛(ài)軍 李亞杰

力學(xué)刺激對(duì)軟骨細(xì)胞的功能活動(dòng)及骨的正常發(fā)育與成熟具有重要影響，而甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP) 在骺板軟骨分化發(fā)育中起關(guān)鍵作用，在鈣磷代謝、骨礦化等方面發(fā)揮生物學(xué)作用[1]。骺板軟骨前體干細(xì)胞(PSC)是骺板周圍軟骨膜及靜止區(qū)中存在的一類可以分裂增殖、自我更新的成體干細(xì)胞[2]。本研究采用動(dòng)態(tài)壓力細(xì)胞培養(yǎng)裝置對(duì)體外培養(yǎng)的骺板軟骨PSC予不同強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的壓力刺激，探討其對(duì)PTHrP mRNA表達(dá)水平的影響及相互聯(lián)系，并借助于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，尋找和發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)壓力作用下調(diào)控軟骨細(xì)胞代謝和功能改變的特定的蛋白質(zhì)分子，為動(dòng)態(tài)壓力作用下軟骨改建機(jī)制的更深入研究提供依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新生24 h SD大鼠，SPF清潔級(jí)，雌雄不限，體質(zhì)量(5.2±0.5)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)為粵檢證字2002A015號(hào)。

二、主要試劑及儀器

胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))，胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、瓊脂糖(Sigma公司，美國(guó))，DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，兔多克隆成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-3(FGFR-3)抗體(SantaCruz公司，美國(guó))，Trizol試劑(Invitrogen公司，美國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司，日本)， PCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)；miniMACS磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)及相關(guān)試劑(Miltenyi公司，德國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma公司，美國(guó))，倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)，熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)，PCR儀(Eppendorf公司，德國(guó))，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-RAD公司，美國(guó))，可控動(dòng)態(tài)細(xì)胞壓力加載裝置(由中山大學(xué)骨科研究所提供)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.骺板軟骨PSC的分離純化及培養(yǎng)鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)[3]的方法，以顯微手術(shù)器械剪取股骨下端骺板兩端的軟骨膜組織充分剪碎，用2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min后離心2 min，棄上清后用1.0 g/L Ⅱ型膠原酶37℃消化2 h，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，離心8 min后收集細(xì)胞，調(diào)整密度后接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用miniMACS磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)分離純化PSC，原代細(xì)胞消化后通過(guò)單細(xì)胞濾器懸浮于Buffer溶液中，加入多克隆抗體FGFR-3，孵育15 min，離心洗滌后加入免疫磁珠室溫孵育15 min，洗滌后通過(guò)磁場(chǎng)，按使用說(shuō)明獲得純化后的FGFR-3陽(yáng)性細(xì)胞。收集第3代PSC，用免疫熒光試劑盒檢測(cè)細(xì)胞FGFR-3的表達(dá)情況。

2.實(shí)驗(yàn)分組及處理

將體外培養(yǎng)的第3代PSC分為30、60、90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)組和對(duì)照組，各組再分2、6、24 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組，總計(jì)12組，每組3個(gè)樣本。采用開(kāi)放式壓力控制培養(yǎng)系統(tǒng)，通過(guò)壓力表觀察具體壓力數(shù)值并記錄加壓時(shí)間。

3.半定量PCR

用Trizol一步法提取各組細(xì)胞總RNA(具體操作按說(shuō)明書步驟進(jìn)行)，分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度，取1 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒一步法得到模板DNA。然后取各組模板DNA 1 μl分別加入上、下游引物(10 μmol)各1 μl、2倍體積PCR Taq混和物12.5 μl (含100 mmol KCl，20 mmol Tris-HCl，3 mmol MgCl2，500 μmol dNTP 混和物，0.1 U/μl Taq DNA聚合酶等)，補(bǔ)足超純水至25 μl。PCR擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min，于94℃變性20 s，退火20 s，72℃延伸15 s，退火溫度60℃及循環(huán)32次。PTHrP基因的引物序列，正向5’-GACTTGCCCTTGTCATGCAGT-3’，反向5’-GGAGCGTCCTGGTGTTCCT-3’。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。制備2%瓊脂糖凝膠，對(duì)各組PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)分析軟件照相，并對(duì)各電泳條帶吸光灰度度值進(jìn)行分析。

4.雙向電泳圖像分析和差異斑點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

參考文獻(xiàn)[4]的方法，設(shè)置參數(shù)，處理分離樣品蛋白組織。使用歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)法行銀染色。掃描圖像后采用ImageMaster 2-D Elite Software 5.0圖像分析軟件對(duì)凝膠進(jìn)行分析，以蛋白點(diǎn)體積為指標(biāo)，點(diǎn)體積圖像小于1.0×e5及大于1.0×e8(蛋白質(zhì)點(diǎn)過(guò)小及過(guò)大) 的蛋白質(zhì)點(diǎn)不納入差異分析，用DeCyder V6.0 分析軟件行DeCye膠內(nèi)差異分析，尋找差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，蛋白點(diǎn)平均體積差異大于2倍(表達(dá)差異上調(diào)2倍或下調(diào)2倍)。使用全自動(dòng)凝膠斑點(diǎn)處理工作站從凝膠中切出斑點(diǎn)，干燥、胰蛋白酶解與基質(zhì)混合后，使用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定(PMF)。使用胰蛋白酶自切峰(842.509，2 211.104)作內(nèi)標(biāo)矯正，使用Frofound軟件在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心非冗余(nr)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的倒置顯微鏡觀察

采用免疫磁珠分選系統(tǒng)剛分離的PSC呈圓形，折光性好，12 h后開(kāi)始沉降貼壁，逐漸伸展為多邊形，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)(圖1A)。細(xì)胞傳至第3代后的細(xì)胞狀態(tài)較好，增殖速度較快，細(xì)胞FGFR-3免疫熒光染色仍呈陽(yáng)性表達(dá)(圖1B)；隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞逐漸以梭形為主，折光性降低，細(xì)胞增殖速度明顯減慢。

圖1 PSC的顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察(×200)

二、不同強(qiáng)度和刺激時(shí)間對(duì)PSC PTHrP mRNA表達(dá)水平的影響

電泳圖像顯示，各組細(xì)胞均有不同程度的PTHrP mRNA表達(dá)，見(jiàn)圖2A。各時(shí)間點(diǎn)不同壓力強(qiáng)度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.597，P<0.05)，壓力值越大，相同時(shí)間點(diǎn)mRNA相對(duì)表達(dá)量越高。細(xì)胞給予動(dòng)態(tài)壓力刺激2 h后，各實(shí)驗(yàn)組PTHrP mRNA的表達(dá)水平均高于對(duì)照組 (P均<0.01)；隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，PTHrP mRNA的表達(dá)水平也逐漸升高。刺激24 h后各實(shí)驗(yàn)組PTHrP mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)，見(jiàn)圖2B。

圖2 動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力作用下不同強(qiáng)度和時(shí)間點(diǎn)PTHrP mRNA表達(dá)情況

三、不同強(qiáng)度和刺激時(shí)間對(duì)PSC細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)組表達(dá)水平的影響

在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間呈差異表達(dá)共有6種蛋白質(zhì)，分別為：脯氨酰羥化酶α亞單位(PHα)、丙酮酸激酶(PK)、L-乳酸脫氫酶(LDH)、脯氨酰羥化酶β亞單位(PHβ)、細(xì)胞骨架蛋白destrin和烯醇酶(enolase)，見(jiàn)圖3及圖4。兩組間6種蛋白定量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖3 實(shí)驗(yàn)組(A)和對(duì)照組(B)雙向電泳圖譜

圖4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組雙向電泳圖譜差異斑點(diǎn)放大圖

圖5 6種差異蛋白在正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)比較

討 論

力學(xué)刺激作為細(xì)胞外信號(hào)，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可引起骺板細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)的一系列變化，進(jìn)而影響細(xì)胞功能代謝，但是軟骨細(xì)胞對(duì)不同性質(zhì)的力學(xué)刺激有不同反應(yīng)的機(jī)制以及體內(nèi)激素、相關(guān)細(xì)胞因子的變化和聯(lián)系尚不明確。有報(bào)道，軟骨細(xì)胞的增殖分化在壓力下改變較為明顯，這可能與細(xì)胞PTHrP的表達(dá)改變有關(guān)[5]。PTHrP在各種種屬發(fā)育和成熟的組織中廣泛表達(dá)，主要通過(guò)旁分泌和自分泌途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，在鈣磷代謝、骨礦化和細(xì)胞生長(zhǎng)分化、細(xì)胞外基質(zhì)分泌等許多方面發(fā)揮重要生物學(xué)作用。本研究顯示，PSC在動(dòng)態(tài)壓力培養(yǎng)環(huán)境下，各時(shí)間點(diǎn)PTHrP表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組；PTHrP mRNA的表達(dá)水平隨時(shí)間增加而升高；同一時(shí)間點(diǎn)，壓力越大， PTHrP mRNA表達(dá)水平越高。結(jié)果提示適當(dāng)?shù)呢?fù)荷力刺激能上調(diào)PTHrP表達(dá)水平，PTHrP在力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可能起重要作用。

本研究進(jìn)一步借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，尋找和發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)壓力作用下調(diào)控軟骨細(xì)胞代謝和功能改變的特定的蛋白質(zhì)分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了6種在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間呈差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，分別為代謝相關(guān)酶(如烯醇酶、PK、LDH、PHα、PHβ)和細(xì)胞骨架蛋白destrin。

脯氨酰羥化酶(PH)屬于二硫化物異構(gòu)酶，可引起蛋白外表結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在人類主要存在α、β、γ3個(gè)亞型，其中PHα和PHβ在軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的合成中起重要作用[6]。PHα和PHβ在正常和骨關(guān)節(jié)炎軟骨中均有表達(dá)，骨關(guān)節(jié)炎患者的PHβ表達(dá)水平可有升高。PK廣泛存在于人體各組織細(xì)胞漿內(nèi)，是糖酵解途徑3個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。PK催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，影響糖酵解的速度。有?bào)道，正常細(xì)胞PK活性處于低水平，當(dāng)局部缺血、缺氧，PK活性明顯增高[7]。LDH是一種普遍存在的細(xì)胞溶質(zhì)酶，主要催化糖酵解。既往研究顯示，健康軟骨中的LDH水平從表面到深層逐漸下降，而在病變軟骨中缺乏LDH表達(dá)[8]。Actin細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞表型的重要調(diào)節(jié)者，其主要作用是維持細(xì)胞的機(jī)械完整性。Destrin屬于肌動(dòng)蛋白Actin黏附蛋白ADF家族，其基因編碼了Actin的脫聚合物Cofilin，可提高體內(nèi)Actin的轉(zhuǎn)化率[9]。烯醇酶是參與糖酵解的一組酶，其催化2-磷酸甘油酸向烯醇式丙酮酸的轉(zhuǎn)化，在ATP的合成代謝過(guò)程中起重要作用[10]。烯醇酶除了在糖酵解過(guò)程中發(fā)揮作用，還是缺氧誘導(dǎo)因子的靶基因，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖上起關(guān)鍵的作用。業(yè)已證實(shí)，在低氧環(huán)境和前炎癥因子刺激下烯醇酶水平升高，而這兩個(gè)都是軟骨破壞的重要因素[11]。本研究顯示，在給予PSC 90 mm Hg持續(xù)24 h的動(dòng)態(tài)壓力后，發(fā)生改變的蛋白多數(shù)是能量代謝蛋白，而且實(shí)驗(yàn)組的6種蛋白質(zhì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組，可能是壓力刺激作用于PSC，促進(jìn)了軟骨基質(zhì)的生物合成和轉(zhuǎn)化，促使軟骨改建。但實(shí)驗(yàn)所得陽(yáng)性意義的信息畢竟是有限的，除去實(shí)驗(yàn)方法本身客觀存在的局限性之外，實(shí)驗(yàn)操作太過(guò)繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期漫長(zhǎng)，且實(shí)驗(yàn)消耗也是相當(dāng)昂貴的。雖然得到了6個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，但調(diào)控其表達(dá)的上下游關(guān)系還不清楚，其所代表的壓力作用下調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的信號(hào)分子通路也不得而知，同時(shí)，候選蛋白也只是代表了翻譯水平的差異，對(duì)其功能認(rèn)識(shí)還需要進(jìn)一步探討研究。

總之，本研究通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了動(dòng)態(tài)壓力作用下調(diào)控終板軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為的6個(gè)有意義的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，并推測(cè)了其在軟骨改建中的作用。為今后研究這些差異蛋白在骺板軟骨細(xì)胞受壓力刺激后代謝和功能變化的生物學(xué)作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Longo A, Librizzi M, Naselli F,et al. PTHrP in differentiating human mesenchymal stem cells: Transcript isoform expression, promoter methylation, and protein accumulation. Biochimie，2013，95：1888-1896.

[2] Guo X, Chu X, Li W, et al. Chondrogenic effect of precartilaginous stem cells following NLS-TAT cell penetrating peptide-assisted transfection of eukaryotic hTGFβ3. J Cell Biochem，2013，114：2588-2594.

[3] 李貴剛，張迪，李昆朋，等. 動(dòng)態(tài)壓應(yīng)力對(duì)生長(zhǎng)板軟骨前體干細(xì)胞PTHrP及細(xì)胞外基質(zhì)mRNA表達(dá)的影響 .中華小兒外科雜志，2010，31：382-386.

[4] Jin S, Shen JN, Guo QC, et al. 2-D DIGE and?MALDI-TOF-MS analysis of the serum proteome in human osteosarcoma. Proteomics Clin Appl，2007，1：272-285.

[5] 胡靜, 鄒淑娟. 機(jī)械牽張對(duì)人成骨樣細(xì)胞增殖能力的影響. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 18：447-448.

[6] Pan PW, Zhang Q, Bai F, et al. Profiling and comparative analysis of glycoproteins in Hs578BST and Hs578T and investigation ofprolyl 4-hydroxylase alpha polypeptide II expression and influence in breast cancer cells. Biochemistry (Mosc)，2012，77：539-545.

[7] Bluemlein K, Glückmann M, Grüning NM, et al. Pyruvate kinase is a dosage-dependent regulator of cellular amino acid homeostasis. Oncotarget，2012，3：1356-1369.

[8] Doughty MJ. Impact of hypotonic solutions on the stromal swelling, lactate dehydrogenase and aldehydedehydrogenase activity of the keratocytes of the bovine cornea. Cell Biol Int，2004，28：593-607.

[9] Jin K, Ren DD, Chi FL, et al. Changes in ADF/destrin expression in the development of hair cells following Atoh1-induced ectopic regeneration. Exp Ther Med，2013，6：177-183.

[10] Marzoni M, Castillo A, Sagona S, et al. A proteomic approach to identify seminal plasma proteins in roosters (Gallus gallus domesticus). Anim Reprod Sci，2013，140：216-223.

[11] 李煌，李松，吳拓江，等.周期性單軸壓應(yīng)力下大鼠髁突軟骨細(xì)胞早期應(yīng)答機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)初探.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，9：263-271.