田宇 胡玉芝 魯衍強(qiáng) 馬少杰 楊琦

葉酸為水溶性B族維生素，在體內(nèi)主要參與一碳單位的轉(zhuǎn)運(yùn)，是核酸合成的必要元素，也是細(xì)胞生長和組織修復(fù)必需物質(zhì)。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的關(guān)鍵酶。MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)與MTRR基因A66G位點(diǎn)的多態(tài)性會(huì)影響MTHFR與MTRR的酶活性降低，造成葉酸代謝異常，阻礙同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸，引起高同型半胱氨酸血癥，臨床上會(huì)增加孕婦生產(chǎn)神經(jīng)管畸形胎兒、唇腭裂胎兒、唐氏綜合征胎兒與先天性心臟病胎兒的風(fēng)險(xiǎn)[1-5]。為此，本研究對無錫市育齡婦女葉酸代謝基因MTHFR和MTRR相關(guān)位點(diǎn)多態(tài)性分布進(jìn)行分析，了解無錫地區(qū)婦女葉酸代謝相關(guān)基因的分布特點(diǎn)與群體遺傳學(xué)特征，為本地區(qū)預(yù)防出生缺陷制定針對性的干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

選取無錫市2009年3月至2012年6月在無錫虹橋醫(yī)院進(jìn)行孕前與孕期檢查的無親緣關(guān)系女性，根據(jù)知情同意原則，經(jīng)受檢者本人同意后，采集其口腔黏膜細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。對所有口腔黏膜細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA抽提，排除抽提不符合要求者，共獲得有效樣本524例，其中，漢族521例，少數(shù)民族3例。樣本提供者年齡(27.0±4.8)歲。

二、方 法

采集受檢者的口腔黏膜上皮細(xì)胞，利用硅膠吸附方法抽提樣本的基因組DNA。采用熒光定量PCR技術(shù)，分別檢測分析葉酸代謝相關(guān)的3個(gè)DNA單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G)。每個(gè)反應(yīng)體系總體積10 μl，包含20 ng/μl的模板DNA 1 μl， Taqman通用混合物5 μl， Taqman-MGB探針0.5 μl，去離子水3.5 μl。其中，MTHFR C667T、A1298C與MTHRR A66G具體探針信息見表1，相關(guān)儀器、試劑均購自美國ABI公司。反應(yīng)條件為95℃預(yù)熱10 min，其后，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)92℃變性15 s，60℃延伸1 min，再改變條件擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)89℃變性15 s， 60℃延伸90 s。反應(yīng)完成后，在ABI7900 型熒光定量 PCR儀上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，利用分析軟件確定各個(gè)樣本的基因分型結(jié)果。

表1 Taqman-MGB探針?biāo)谖恢?/p>

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對研究人群進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)后，采用SPSS 18.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并將無錫地區(qū)3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的分布頻率分別與山東省[6]、河南省[6]、廣東省[7]、海南省[6]等地區(qū)的多態(tài)性分布頻率相比較，兩地區(qū)間的基因多態(tài)性頻率分布的差異比較采用行×列χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因分型

基因組樣本經(jīng)熒光定量PCR反應(yīng)后，所得結(jié)果利用分析軟件分析確定各樣本基因型，結(jié)果見圖1，從左往右依次是MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G。

圖1 基因分型圖

二、Hardy-Weinberg平衡分析

無錫女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果均為優(yōu)良(C677T：χ2=0.525，P>0.05；A1298T：χ2=1.8，P>0.05；A66G：χ2=0.341，P>0.05)，樣本具有區(qū)域群體代表性。

三、無錫女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)基因多態(tài)性分布頻率域特點(diǎn)

1.MTHFRC677T

無錫女性MTHFR基因 C677T位點(diǎn)TT基因型的分布頻率為18.9%，低于CC基因型(35.3%)和雜合子CT基因型(45.8%)，純合子基因型的分布情況與山東省、河南省該基因位點(diǎn)多態(tài)性的分布情況相反；與廣東省、海南省的基因多態(tài)性分布類似，其TT基因型的出現(xiàn)頻率高于廣東省(7.4%)和海南省(9.4%)，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。MTHFR C677T等位基因的構(gòu)成與上述4個(gè)地區(qū)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，見表1。

表2 無錫地區(qū)與其他地區(qū)女性MTHFR C677T位點(diǎn)基因型頻數(shù)和頻率分布比較 例(%)

2.MTHFRA1298C

MTHFR基因A1298C位點(diǎn)的基因型構(gòu)成與廣東省和海南省的基因型構(gòu)成比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。A1298C位點(diǎn)無錫女性的CC基因型出現(xiàn)頻率為3.4%，低于廣東省(5.3%)和海南省(6.9%)。無錫女性中，A1298C位點(diǎn)A等位基因的出現(xiàn)頻率(82.7%)遠(yuǎn)高于C等位基因(17.3%)。等位基因構(gòu)成與山東省、河南省的數(shù)據(jù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與廣東省和海南省的等位基因構(gòu)成比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 無錫地區(qū)與其他地區(qū)女性MTHFR A1298C位點(diǎn)基因型頻數(shù)和頻率分布比較 例(%)

3.MTRRA66G

MTRR基因A66G位點(diǎn)G等位基因的出現(xiàn)頻率為24.9%，低于A等位基因(75.1%)；其中純合子GG基因型的出現(xiàn)頻率為6.7%，低于海南省(9.1%)。A66G位點(diǎn)基因型的構(gòu)成與海南省比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與其他3個(gè)地區(qū)數(shù)據(jù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。等位基因構(gòu)成與山東省、河南省的數(shù)據(jù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與廣東省和海南省的等位基因構(gòu)成比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 無錫地區(qū)與其他地區(qū)女性MTRR A66G位點(diǎn)基因型頻數(shù)和頻率分布比較 例(%)

討 論

近年來，我國出生病死率有所下降，但出生缺陷率卻逐年增高。目前認(rèn)為，MTHFR與MTRR這兩個(gè)葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，其酶活性水平與人體內(nèi)葉酸濃度、血漿同型半胱氨酸濃度均密切相關(guān)。如果MTHFR與MTRR酶的活性降低或濃度降低，則人體內(nèi)的同型半胱氨酸水平增高，可引起神經(jīng)管缺陷、唇腭裂、唐氏綜合征、先天性心臟病等各種出生缺陷。其中神經(jīng)管缺陷是發(fā)生率最高的一類多基因遺傳疾病[8]。MTHFR C677T位點(diǎn)的TT基因型是神經(jīng)管畸形發(fā)生的遺傳高風(fēng)險(xiǎn)因素，TT基因型個(gè)體的MTHFR活性會(huì)比正常個(gè)體下降60%～70%，增加出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。MTHFR A1298C的CC基因型與MTRR A66G的GG基因型[13-14]也是出生缺陷的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素[11-14]。此外，出生缺陷的病因?qū)W研究還表明，出生缺陷的發(fā)生除了與遺傳因素相關(guān)，也受環(huán)境因素(營養(yǎng)因素)影響，它是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。即對由于MTHFR和MTRR風(fēng)險(xiǎn)基因造成其自身葉酸代謝障礙的女性人群，如果和正常人群一樣補(bǔ)充同劑量的葉酸，則其體內(nèi)的血清和紅細(xì)胞葉酸濃度就會(huì)低于正常人群，分娩出生缺陷嬰兒的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)增高；但如果對這類女性增加葉酸的補(bǔ)服劑量，就可以維持她們體內(nèi)正常的血清葉酸水平，降低出生缺陷的發(fā)生[15]。

本研究首次收集無錫地區(qū)500多名婦女的遺傳樣本，對MTHFR和MTRR基因相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行遺傳檢測。結(jié)果顯示，無錫市婦女葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性具有地區(qū)差異。其MTHFR基因C677T位點(diǎn)的TT型風(fēng)險(xiǎn)基因的分布頻率為18.9%，高于廣東省、海南省的TT基因型的分布頻率(10%左右)，而無錫市2011年圍生兒出生缺陷監(jiān)測結(jié)果顯示，無錫市2011年出生缺陷率為4.98‰ ，遠(yuǎn)低于同期廣東省和海南省9.89‰的出生缺陷率[16-19]。無錫市婦女MTHFR A1298C與MTRR A66G基因多態(tài)性的分布情況與山東省、河南省相似，無錫市的出生缺陷率也低于山東省12.46‰與河南省(2007年)9.17‰的出生缺陷率[20-21]。這與無錫市積極推廣婦女孕前及孕后葉酸普服項(xiàng)目和擁有相對較高的產(chǎn)前篩查和診斷水平密切相關(guān)。因此，積極開展的出生缺陷高危因素的篩查，并提前實(shí)施相對應(yīng)的有效干預(yù)措施(如補(bǔ)服葉酸)，可降低出生缺陷的發(fā)生率。

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