李素娥 唐駿 吳樂(lè)天

EB病毒屬皰疹病毒群的一種雙鏈DNA病毒,它可引起多種器官的損害，腎損害是其中一種常見(jiàn)的類型，過(guò)去有很多研究表明，EB病毒可以引起腎小球腎炎、腎損害等[1-2]。但筆者發(fā)現(xiàn)EB病毒感染與兒童原發(fā)性腎病綜合征(PNS)關(guān)系的研究報(bào)告并不多見(jiàn)，故探討了兩者的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

2010年1月至2014年1月在本院兒科住院的66例PNS患兒為研究對(duì)象，全部病例均符合第6版人民衛(wèi)生出版社出版的《兒科學(xué)》中PNS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為首次發(fā)病的未經(jīng)治療初診者，并排除近親三代內(nèi)曾患有類似疾病的病例。66例中男49例、女17例，年齡11個(gè)月～13歲9個(gè)月、中位年齡6歲4個(gè)月,病程2周～2年7個(gè)月、中位病程1個(gè)月1周，按PNS類型再將66例PNS患兒分為單純型及腎炎型進(jìn)行分析，66例均無(wú)呼吸、消化或心血管系統(tǒng)感染性疾病。由于醫(yī)學(xué)倫理及知情同意原因，本研究選取了同期住院的68例非腎臟病患兒作為對(duì)照組，其中男45例、女23例，年齡8個(gè)月～12歲5個(gè)月、中位年齡6歲2個(gè)月，急性上呼吸道感染29例、肺炎21例、腹瀉病18例，68例既往均無(wú)腎臟疾病史及其他重要臟器疾病史。兩組在年齡、性別方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院論理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組患兒家長(zhǎng)均知情同意。

二、方 法

1.標(biāo)本收集

血液標(biāo)本的收集及檢驗(yàn)：采用腎上腺皮質(zhì)激素(激素)治療前，用抗凝采血管收集PNS組和對(duì)照組外周靜脈血5 ml，取1 ml稀釋并加入淋巴細(xì)胞分離液，收集中間單個(gè)核細(xì)胞層，加入DNA提取液提取細(xì)胞DNA，其余血液行抗EB病毒殼抗原抗體VCA-IgM、VCA-IgG以及異形淋巴細(xì)胞檢測(cè)。

腎組織標(biāo)本的收集及檢驗(yàn)：激素治療前，對(duì)PNS患兒行腎活組織病理學(xué)檢查(活檢)，對(duì)照組因考慮醫(yī)學(xué)倫理原因未行腎活檢，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗腎組織3次，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋,從石蠟包埋組織塊切取約5～7 μm的薄片,用二甲苯脫蠟, 無(wú)水乙醇漂洗,晾干沉淀，加入組織裂解液50 μl和蛋白酶K 2 μl，置55℃30 min，100℃煮沸10 min，14 000 r/min離心l0 min，取上清液作PCR反應(yīng)模板[3]。

2.反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)EBVDNA的表達(dá)

使用日本Takara公司設(shè)計(jì)并合成的引物，上游引物：5’-GTTCGCGTTGCTAGGCCACC-3’;下游引物：5’-AGGACCACTTATACCAGGG-3’，長(zhǎng)度為109 bp。并根據(jù)反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)血液細(xì)胞提取液及腎組織提取的上清液建立PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94℃、5 min，94℃、50 s,55℃、50 s，72℃、45 s，33個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖電泳鑒定目的條帶。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18軟件處理數(shù)據(jù),率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PNS組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

PNS組提示近期感染的血VCA-IgM及提示既往感染的VCA-IgG的陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(P均<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 PNS組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 例(%)

二、單純型與腎炎型PNS各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

按PNS類型將PNS患兒分為單純型及腎炎型進(jìn)行分析，腎炎型PNS患兒中VCA-IgM及VCA-IgG陽(yáng)性率較單純型更高，而且其血液及腎臟表達(dá)EBV DNA的陽(yáng)性率也較單純型高(P均<0.05)，見(jiàn)表2。兩種類型PNS及對(duì)照組血和(或)腎EBV DNA反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 單純型與腎炎型PNS以及對(duì)照組血和(或)腎EBV DNA反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果

表2 單純型與腎炎型PNS各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 例(%)

討 論

EB病毒屬于γ皰疹病毒家族，為線性雙鏈DNA病毒，是一種非常常見(jiàn)的感染病毒，人群中感染率高達(dá)90%，學(xué)齡兒童感染后可無(wú)癥狀或出現(xiàn)發(fā)熱、咽峽炎、肝脾及淋巴結(jié)腫大、外周血淋巴細(xì)胞增加并出現(xiàn)異型淋巴細(xì)胞等[4-5]。EB病毒可引起多種疾病，累及全身各個(gè)器官和系統(tǒng)病變[6]。EB病毒在感染機(jī)體時(shí)，機(jī)體通過(guò)自身免疫抑制EB病毒的增值，從而抑制其致病性，但其具有嗜B淋巴細(xì)胞性，可終生潛伏在機(jī)體的B淋巴細(xì)胞中，使其不能完全被機(jī)體清除，達(dá)到免疫逃逸的目的，當(dāng)在某些致病因素作用下或在適當(dāng)?shù)臈l件下，其可大量增值并引發(fā)相關(guān)疾病。在一些免疫系統(tǒng)疾病如SLE、原發(fā)性干燥綜合征等的研究中發(fā)現(xiàn)，EB病毒感染可引起免疫系統(tǒng)功能的紊亂。

本研究顯示EB病毒與單純性及腎炎性PNS均有關(guān)聯(lián)(為了盡量避免對(duì)照組出現(xiàn)假陽(yáng)性，本研究除了檢測(cè)VCA-IgM、VCA-IgG，也檢測(cè)了血EBV DNA及異形淋巴細(xì)胞)。單純性PNS發(fā)病機(jī)制尚未明確，其腎組織中雖然未見(jiàn)有免疫球蛋白和補(bǔ)體沉積，但出現(xiàn)T細(xì)胞功能的紊亂，因此可能與細(xì)胞免疫功能有關(guān)。EB病毒在侵犯B淋巴細(xì)胞后,使B淋巴細(xì)胞發(fā)生抗原性改變,并進(jìn)一步引起T淋巴細(xì)胞的防御性反應(yīng),形成細(xì)胞毒效應(yīng)，導(dǎo)致受感染機(jī)體細(xì)胞的溶解和死亡[7]。因此我們認(rèn)為，EB病毒可能通過(guò)擾亂細(xì)胞免疫功能引起單純性PNS。通過(guò)免疫熒光檢查可發(fā)現(xiàn)腎炎型PNS患者腎小球基底膜有IgG和C3沉積，提示該病與免疫復(fù)合物損害有關(guān)。Joh(1998年)與Andersson(2000年)等對(duì)間質(zhì)性腎炎的病理切片進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，腎小球上可見(jiàn)有免疫復(fù)合物介導(dǎo)的損傷。因此，我們考慮EB病毒引起的免疫復(fù)合物可造成腎小球基底膜的損害，從而引起腎炎性PNS。

EB病毒是一種常見(jiàn)的感染性病毒，人群中感染率不低，本文通過(guò)相關(guān)的臨床資料以及實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)EB病毒與兒童PNS可能存在一定關(guān)聯(lián)，因此在臨床上，對(duì)PNS的患兒還應(yīng)注意行EBV的相關(guān)檢查及抗病毒治療。

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