張文靜， 崔麗艷， 張 捷

(北京大學第三醫(yī)院檢驗科，北京100191)

“自噬”(autophagy)是廣泛存在于真核細胞生物中的一種細胞自我吞噬的現(xiàn)象，在正常生理狀態(tài)下，細胞自噬維持在很低的基線水平，用以清除衰老的細胞器及降解異常積聚的蛋白質(zhì)，從而保持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當細胞處于饑餓、生長因子缺乏或高能量需求狀態(tài)時，自噬水平迅速上調(diào)。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)自噬參與多種疾病的發(fā)生過程，如感染、腫瘤、神經(jīng)元退變性疾病和心臟疾病等［1］。其中心、腦、腎等疾病的發(fā)生均與缺血再灌注損傷密切相關。研究表明自噬在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，因此，自噬也與這些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。然而，在缺血再灌注損傷發(fā)生的過程中自噬究竟是發(fā)揮保護性作用還是進一步加重損害目前仍無定論，本研究將就自噬及其在缺血再灌注損傷中的作用進行綜述。

一、自噬及其生理意義

真核細胞可以通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬這兩種方式來降解蛋白質(zhì)，其中自噬主要負責降解長壽命蛋白和一些細胞器。自噬是一個動態(tài)的過程，當自噬被誘導后，首先在細胞內(nèi)出現(xiàn)單層膜結(jié)構(gòu)，進而單層膜凹陷形成雙層膜樣的分隔膜，完全包裹胞內(nèi)待降解物成為自噬體，最終被運送至溶酶體并被溶酶體降解［2］。根據(jù)底物進入溶酶體途徑的不同，自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬這3種類型，它們在分子機制和功能方面截然不同［3］，其中，人們對巨自噬的研究最為廣泛而深入，通常所說的“細胞自噬”主要是指巨自噬。

當細胞處于營養(yǎng)缺乏的狀態(tài)時，清除胞內(nèi)耗能且無用的蛋白質(zhì)及細胞器變得十分必要，此時通過自噬可以將其降解并產(chǎn)生能量供細胞利用。因此，自噬一直被認為是細胞的一種保護性作用，在維持缺血缺氧等應激狀態(tài)下細胞存活、清除細胞內(nèi)衰老細胞器及錯誤折疊蛋白中起重要作用［4］。然而，過度的自噬不但不能起到保護細胞的作用，反而會促進細胞的死亡，這樣的死亡細胞不具備凋亡的典型特點，如核固縮、核破裂、細胞皺縮，沒有凋亡小體的形成，也不具備細胞壞死的特點，是不同于調(diào)亡和壞死的一種新的細胞程序性死亡，被稱為自噬性細胞死亡或Ⅱ型程序性細胞死亡［5］。

二、自噬的誘導和分子調(diào)控

自噬作為一種重要的物質(zhì)代謝方式，其發(fā)生發(fā)展受到嚴格的調(diào)節(jié)和控制，通常是由自噬相關基因(Atg)來調(diào)節(jié)的。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在酵母菌及其他真菌體內(nèi)至少存在32種Atg［6］，其中大部分的Atg基因在高等真核細胞生物中也是保守存在的并發(fā)揮相似的功能。

自噬的發(fā)生過程可以被劃分成4個獨立卻又連續(xù)的步驟:(1)接受自噬誘導物的刺激并誘導自噬;(2)自噬體的形成;(3)自噬體與溶酶體膜的融合;(4)自噬體的降解［7］。參與自噬的有3個關鍵的蛋白復合物，包括Atg1復合物、雷帕霉素作用靶點復合物1(TORC1)和Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶復合物(PI3K)［6］。在自噬過程中，他們發(fā)揮各自不同的作用。

當細胞受到細胞外的(如外界中的營養(yǎng)成分、缺血缺氧、生長因子的濃度等)和細胞內(nèi)的(如代謝壓力、衰老或破損的細胞器、折疊錯誤或聚集的蛋白質(zhì)等)刺激后，TORC1作為饑餓感受器，可感受細胞的營養(yǎng)狀態(tài)［8］，并激活AMP-活化蛋白激酶(AMPK)，使mTOR磷酸化并使其活性下降［9］。實驗證明，營養(yǎng)缺乏或直接使用雷帕霉素抑制mTOR活性，很可能同時激活某種磷酸酶，導致Atg13部分脫磷酸化，使之與Atg1緊密結(jié)合［10］，這種結(jié)合可以使Atg1活化，為自噬體的形成奠定基礎［7］。除此之外，自噬體的聚集和形成還需要一個關鍵的復合物，就是Ⅲ型PI3K復合物，其中包括哺乳動物自噬相關蛋白Beclin1，能夠招募其他的結(jié)構(gòu)蛋白到自噬體的膜上［11］，有助于自噬體的形成。與此作用相反的是，I型PI3K卻可以通過Akt抑制自噬的發(fā)生［12］。

三、自噬在缺血再灌注損傷中的作用

缺血所引起的組織損傷是致死性疾病的主要原因，如心肌梗死、腦卒中、肝腎缺血等。大量研究發(fā)現(xiàn)對組織造成損傷的主要因素，不是缺血本身，而是恢復血液供應后，過量的自由基攻擊這部分重新獲得血液供應的組織內(nèi)的細胞造成的，被稱為“缺血再灌注損傷”。

目前，大量的科學研究表明，當器官發(fā)生缺血再灌注損傷時，機體會上調(diào)自噬水平。通過電鏡觀察自噬體形成，或者通過檢測Atg的mRNA和蛋白水平等方法均可證實這一結(jié)論。對大鼠心臟進行缺血處理后，能觀察到心肌細胞內(nèi)自噬體明顯增加［13］，在缺血再灌注的胎鼠心肌細胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了自噬增強的證據(jù)［14］。同時，Rami等［15］發(fā)現(xiàn)在腦缺血灶中細胞死亡的同時伴有Beclin1表達的升高，說明細胞死亡同時伴隨自噬的發(fā)生。Suzuki等［16］在腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷的小鼠模型和人的移植腎活組織標本中均發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞中自噬體增多的現(xiàn)象，說明在腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷時自噬水平也是上調(diào)的。因此，在發(fā)生缺血再灌注損傷時自噬增強是毋庸置疑的。但是，研究結(jié)果顯示，雖然自噬在心肌缺血中起保護性作用，但在再灌注階段對心肌有害［17］?？梢?，在缺血階段和再灌注階段自噬發(fā)揮的作用是不同的，其分子機制也有所不同，以下將分別進行闡述。

1.自噬在器官缺血缺氧時發(fā)揮的作用及其相關分子機制 近年來，大量利用缺血缺氧動物模型和細胞培養(yǎng)的實驗已經(jīng)證實了自噬不僅對營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的細胞起保護作用，而且能促進細胞存活。Kim等［18］觀察到處于冬眠狀態(tài)的心肌細胞內(nèi)自噬體明顯增加，自噬相關蛋白Beclin1水平上調(diào)，同時心肌細胞的調(diào)亡水平下降，心肌梗死面積減小，說明自噬的增強對缺血的心肌細胞起到了保護性作用。正常的新生鼠在出生后短期內(nèi)能通過提高自噬來維持存活，而敲除了自噬相關基因Atg5或Atg7的新生鼠出生后很快死亡［14］。該現(xiàn)象進一步證實了自噬在器官缺血階段對細胞的保護性作用。

在器官缺血缺氧階段，細胞內(nèi)的ATP水平明顯下降，導致 AMP/ATP比例增高，此時，AMPK作為感受器能接受能量減少的信號而被激活，AMPK的激活不僅通過磷酸化TSC2而抑制了mTOR的活性，而且促進了eEF2的磷酸化。該過程能夠抑制蛋白質(zhì)合成，誘導自噬產(chǎn)生，幫助機體適應缺氧環(huán)境［19］。Matsui等［17］通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠心肌缺血再灌注模型，對心肌細胞使用AMPK的抑制劑后，觀察到心肌細胞內(nèi)微管相關蛋白輕鏈3的Ⅱ型與Ⅰ型之比(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)的比值減小，自噬作用被抑制，細胞死亡數(shù)目增加，證實了AMPK-mTOR途徑是心肌缺血時自噬產(chǎn)生的主要信號通路。

除了mTOR途徑以外，凋亡相關蛋白Bcl-2在細胞缺血缺氧時被磷酸化，從而失去與Beclin1的結(jié)合作用，同樣可以誘導自噬的產(chǎn)生。因此，抑制Bcl-2蛋白能抑制Beclin1依賴性自噬，可能是缺血缺氧狀態(tài)下主要的非mTOR的自噬調(diào)節(jié)途徑［20］。另有報道，缺氧誘導因子-1(HIF-1)在細胞缺血缺氧時可以通過上調(diào)表達水平來促進自噬的產(chǎn)生［21］。以上研究結(jié)果顯示，在細胞缺血缺氧階段，機體主要通過mTOR途徑誘導自噬的產(chǎn)生，從而起到保護細胞、促進細胞存活的作用，其作用機制有可能是通過抑制凋亡而促使缺血細胞存活［22］。有關這方面機制的研究仍需進一步探討。

2.自噬在器官再灌注階段發(fā)揮的作用及其相關分子機制 盡管有人猜測當器官出現(xiàn)再灌注時，隨著缺血狀態(tài)的緩解，自噬也應該逐漸減弱，但事實證明在再灌注階段自噬是增強的［17］。而過度的自噬會導致自噬性細胞死亡，這種自噬性細胞死亡常常伴隨細胞凋亡和細胞壞死的現(xiàn)象，因此有人猜測自噬過度時，有可能會觸發(fā)細胞的凋亡程序而引起細胞死亡［23］，同時，也有研究認為自噬和細胞凋亡是同時存在的，并且它們之間存在相互協(xié)作與相互制約的雙重作用［24］。研究結(jié)果顯示，一些被我們所熟知的凋亡誘導物能夠同時激活自噬［25］，說明自噬與凋亡在分子調(diào)控通路上存在相同的調(diào)控物。但是，到目前為止，對于究竟是自噬誘導細胞凋亡還是自噬伴隨細胞凋亡這一問題仍存在爭議。

Gotoh等［26］構(gòu)建了大鼠肝臟的缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)在再灌注階段，自噬增強，肝細胞大量脫落并阻塞肝血竇，使得肝臟大面積壞死。Suzuki等［16］對同種異體腎移植的鼠腎進行缺血再灌注，并利用自噬抑制劑3-MA抑制自噬，發(fā)現(xiàn)細胞死亡的數(shù)量減少。除此之外，通過對小鼠進行Beclin1基因敲除，再進行缺血再灌注模型的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)基因敲除后小鼠心肌細胞的自噬和凋亡水平均下降，心肌梗死面積減?。?7］。Matsui等［17］通過實驗證明在心肌再灌注階段，細胞自噬作用的上調(diào)主要靠Beclin1的表達增強。通過抑制Beclin1的表達，可抑制細胞在再灌注階段的自噬作用，減輕心肌自噬性細胞死亡程度。說明在再灌注階段，過度的自噬可以加重細胞損傷并導致細胞的自噬性死亡，其主要機制可能與Beclin1與Bcl-2之間的相互作用相關。近來也有人發(fā)現(xiàn)活性氧ROS在鼠心臟的缺血/再灌注中對于上調(diào)Beclin1的表達及誘導自噬中起關鍵作用，而這一作用在再灌注階段尤為重要［28］。說明在細胞再灌注階段，機體主要通過Beclin1的表達增強進一步加重自噬，最終導致細胞的死亡。

綜上所述，自噬是機體在缺血/再灌注損傷時的一種生理性反應，主要通過激活AMPK并抑制mTOR途徑誘導自噬的產(chǎn)生，有可能通過抑制細胞凋亡對缺血細胞起到保護性作用，然而，在再灌注階段，自噬的產(chǎn)生主要依賴于Beclin1的表達增強，過度的自噬在再灌注階段不利于細胞存活并加重細胞損傷，甚至導致細胞死亡，其作用機制主要與Beclin1與Bcl-2之間的相互作用相關。隨著人們對自噬研究的不斷深入，將來我們可以通過對自噬信號通路上的信號分子進行人為干預，從而調(diào)整自噬水平，作為一種治療手段來盡可能減輕缺血/再灌注損傷用以治療相關疾病。

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