張青峰，張芳婷，申慧芳，高書穎

(1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 生物化學與分子生物學教研室， 廣東 珠海 519041；2.北京大學深圳醫(yī)院 中心實驗室，廣東 深圳 518036)

端粒 (telomere) 位于染色體末端，是由串聯(lián)重復的短雙鏈DNA序列和結合蛋白形成的復合體，在維持基因組完整性和功能穩(wěn)定性方面有著重要作用。重復端粒DNA序列由端粒酶維護。人端粒酶由端粒酶逆轉錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)、端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 和端粒酶相關蛋白 (additional protein components) 組成，hTERT的轉錄調控是限制端粒酶活性的主要因素[1]。研究發(fā)現(xiàn)，hTERT在大多數(shù)正常人體細胞中呈低表達或不表達，而在胚胎發(fā)育期間、在一些干細胞和大多數(shù)腫瘤細胞中表現(xiàn)活性[2]。表達外源hTERT，可以使某些類型的細胞永生化，其中包括馬科動物原代成纖維細胞[3]、人間充質基質細胞[4]、人口腔黏膜上皮細胞[5]、人肝細胞[6]等。

本研究擬構建攜帶hTERT基因的重組慢病毒表達載體，制備重組慢病毒，檢測攜帶hTERT基因的重組慢病毒對HeLa細胞的感染能力，及其介導外源hTERT基因在被感染細胞中的染色體整合和mRNA表達水平，為進一步研究hTERT基因的功能及構建永生化細胞系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株與質粒 人宮頸癌HeLa細胞購自中國科學院上海細胞庫；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；人胚腎293FT細胞、大腸桿菌Stbl3、質粒pENTR 221-hTERT、pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pLenti6.3/V5-DEST等購自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)。重組質粒pLenti6.3/V5-hTERT由本實驗室構建，其結構示意圖(見圖1)。

圖1 重組質粒pLenti6.3/V5-hTERT的結構示意圖

1.2 主要試劑 質粒提取試劑盒、質粒轉染試劑LipofectamineTM2000、LR clonase II enzyme mix和殺稻瘟菌素 (BSD) 等購自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)；Taq DNA聚合酶EmeraldAmp PCR Master Mix、限制性內切酶BamHⅠ和PstⅠ購自Takara公司 (Dalian, China)；慢病毒濃縮試劑盒PEG-it Virus Precipitation Solution購自System biosciences公司 (Mountain View, CA, USA)；Polybrene購自Sigma公司 (St. Louis, MO, USA)。

1.3 重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT的構建及酶切鑒定 將克隆載體pENTR221-hTERT、表達載體pLenti6.3/V5-DEST和LR Clonase II enzyme mix于室溫下混合均勻，孵育1～2 h，然后加入Proteinase K溶液終止反應，于37 ℃孵育樣品10 min。將上述反應混合物轉化大腸桿菌Stbl3細胞，在含有Amp抗生素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。提取質粒，用BamHⅠ和PstⅠ分別單酶切質粒，鑒定目的片段的大小和連接方向。

1.4 慢病毒的包裝與濃縮 將293FT細胞接種至10 cm細胞培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。轉染當天，293FT細胞密度為80%～95%時，依照轉染試劑LipofectamineTM2000操作說明將pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pLenti6.3/V5-hTERT四種質粒混合，共轉染293FT細胞，轉染第2天，除去293FT細胞培養(yǎng)基，更換為10 mL不含抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育細胞48～72 h。將培養(yǎng)基上清轉移到15 mL離心管中，4 ℃ 2000 ×g離心15 min，沉淀碎片，使用Millex-HV 0.45 μm PVDF濾器過濾上清，得到含有慢病毒的上清液。參照慢病毒濃縮試劑盒PEG-it Virus Precipitation Solution操作說明對慢病毒上清液進行濃縮，分裝至1.5 mL離心管中，于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組慢病毒攜帶hTERT基因的PCR檢測 取慢病毒濃縮液10 μL，沸水浴15 min，迅速冰浴15 min，提取病毒DNA，進行PCR擴增鑒定。擴增hTERT基因的上游引物為Primer1：5’-GGTGGATGATTTCTTGTTGGTG-3’，下游引物為Primer2：5’-ACCACTGTCTTCCGCAAGTTC-3’。 PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。實驗設無菌水為陰性對照、質粒pENTR221-hTERT為陽性對照。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.6 重組慢病毒感染能力的鑒定 將HeLa細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，慢病毒感染當天細胞密度為40% ～ 50%。用DMEM完全培養(yǎng)基將慢病毒貯存液稀釋100倍，滴加至HeLa細胞培養(yǎng)孔內，同時加入Polybrene至終濃度為6 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。次日，除去含慢病毒的培養(yǎng)基，更換為新鮮DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第3天，更換為含有10 μg/mL BSD的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3～4 d，更換新鮮的含有BSD的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，抗生素篩選10～12 d后，顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.7 外源hTERT基因整合至HeLa細胞基因組的檢測 提取感染重組慢病毒經(jīng)BSD篩選培養(yǎng)的HeLa細胞和對照細胞基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增，引物為Primer1和Primer2。PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.8 HeLa細胞hTERT基因表達的RT-PCR檢測 利用TRIzol試劑 (Invitrogen公司) 提取感染重組慢病毒經(jīng)BSD篩選培養(yǎng)的HeLa細胞和對照細胞總RNA，經(jīng)反轉錄得到cDNA，以此為模板進行PCR擴增。擴增hTERT基因的上下游引物為Primer1和Primer2，擴增片段長度預計為117 bp；內參照GAPDH基因的上游引物為Primer3：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物為Primer4：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，擴增片段長度預計為138 bp。由于hTERT基因和GAPDH基因的擴增片段長度接近，這兩種基因的PCR反應在不同體系中進行。PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。

2 結果

2.1 重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT的構建 克隆載體pENTR 221-hTERT攜帶attL1和attL2位點，位于hTERT基因序列兩端；慢病毒表達載體pLenti6.3/V5-DEST攜帶attR1和attR2位點，位于細胞死亡控制基因ccdB序列兩端。在LR Clonase II enzyme的作用下，pLenti6.3/V5-DEST上的attR1和attR2序列與pENTR221-hTERT上的attL1和attL2序列發(fā)生同源重組，將反應混合物轉化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細胞，經(jīng)Amp抗生素篩選獲得陽性克隆。提取質粒進行酶切鑒定，將重組質粒命名為pLenti6.3/V5-hTERT，其結構示意圖(見圖1)。重組質粒pLenti6.3/V5-hTERT全長11131 bp，酶切鑒定對照質粒pENTR221-hTERT全長5943 bp，兩種質粒均含有BamHⅠ和PstⅠ酶切位點，單切酶后預計形成的DNA片段(見表1)。質粒的單酶切片段電泳結果(見圖2)，圖中顯示，重組質粒和對照質粒經(jīng)BamHⅠ酶切形成的片段大小與預計值完全一致；經(jīng)PstⅠ酶切形成的小片段亮度較弱，大片段與預計值一致。鑒定結果說明，hTERT基因已定向連接至慢病毒表達載體，載體pLenti6.3/V5-DEST上的細胞死亡控制基因ccdB被目的基因hTERT所取代，重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT構建正確。

表1質粒pLenti6.3/V5-hTERT和pENTR221-hTERT經(jīng)BamHⅠ和PstⅠ單酶切形成的DNA片段

限制性內切酶質粒 質粒酶切后形成的DNA片段 (bp)BamHⅠpENTR221-hTERT5943BamHⅠpLenti6.3/V5-hTERT8578, 2553PstⅠpENTR221-hTERT3147, 1260, 825, 496, 185, 30PstⅠpLenti6.3/V5-hTERT8046, 1260, 825, 496, 289, 185, 30

2.2 重組慢病毒攜帶hTERT基因的檢測 采用脂質體轉染法，將攜帶hTERT基因的重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT與包裝質?；旌衔飌LP1、pLP2和pLP/VSVG共轉染至293FT細胞，收集含有慢病毒顆粒的細胞培養(yǎng)基上清，使用PEG-it Virus Precipitation Solution將培養(yǎng)基上清濃縮為原體積的1/50，提取慢病毒DNA，以Primer1和Primer2為引物PCR法檢測重組慢病毒中是否含有hTERT基因。PCR擴增結果見圖3，以無菌水為模板的陰性對照無擴增產(chǎn)物，以質粒pENTR221-hTERT為模板的陽性對照和以重組慢病毒DNA為模板的樣品有特異性擴增片段，片段大小與預計值一致，可見本研究所包裝、濃縮的重組慢病毒攜帶hTERT基因。

2.3 重組慢病毒介導hTERT基因整合至HeLa細胞染色體DNA 將重組慢病毒感染HeLa細胞，經(jīng)BSD篩選培養(yǎng)，得到具有BSD抗性的細胞克隆，經(jīng)傳代培養(yǎng)，提取基因組DNA，PCR擴增鑒定是否含有外源hTERT基因。以Primer1和Primer2為引物擴增HeLa細胞基因組DNA內源hTERT基因得到的片段應為1988 bp，其中含有內含子序列1871 bp；擴增外源hTERT基因得到的片段應為117 bp，為克隆hTERT基因序列，不含有內含子。BSD抗性HeLa細胞和對照HeLa細胞基因組DNA鑒定結果見圖4。由圖4可見，未感染重組慢病毒的對照HeLa細胞，有1條特異性擴增條帶 (泳道1、2中箭頭A所指)，片段大小與內源hTERT基因擴增片段預計值大小一致；感染重組慢病毒經(jīng)BSD篩選的HeLa細胞，有2條特異性擴增條帶，其中大片段 (泳道3、4中箭頭A所指) 與內源hTERT基因擴增片段預計值大小一致，小片段 (泳道3、4中箭頭B所指) 與外源hTERT基因擴增片段預計值大小一致。檢測結果說明，攜帶hTERT基因的重組慢病毒感染HeLa細胞后，介導hTERT基因整合至HeLa細胞染色體DNA。

2.4 重組慢病毒感染對HeLa細胞hTERT基因轉錄水平的影響 采用半定量RT-PCR的方法檢測BSD抗性HeLa細胞中hTERT基因的mRNA表達水平，確定重組慢病毒感染對HeLa細胞hTERT基因轉錄水平的影響，結果(見圖5)。由圖5可見，內參照GAPDH基因在感染重組慢病毒的HeLa細胞和未感染重組慢病毒的對照細胞中的表達量無明顯差異；而hTERT基因在感染重組慢病毒的HeLa細胞中的表達量遠高于對照細胞，說明通過重組慢病毒介導而整合至HeLa細胞染色體DNA的外源hTERT基因，能夠在被感染細胞中得到高表達。

3 討論

端粒酶與腫瘤發(fā)生和細胞衰老有關[2,7]，利用分子生物學技術，將外源hTERT基因導入低表達或不表達hTERT的細胞中，提高細胞內hTERT的表達水平，可以使某些類型的細胞永生化。目前，hTERT基因已被廣泛用于構建人和其它動物永生化細胞系[3-6,8]。慢病毒載體感染是動物細胞表達外源基因的常用方法。與逆轉錄病毒載體、腺病毒載體等其它病毒表達載體相比，慢病毒載體的最大優(yōu)勢是能夠感染分裂和非分裂細胞，將外源基因有效地整合到宿主細胞染色體上，從而實現(xiàn)持久性表達[9]。

本研究所構建的重組慢病毒載體pLenti6.3/V5-hTERT攜帶hTERT基因，同時含有WPRE、cPPT元件和殺稻瘟菌素篩選基因Blasticidin，提供Ψ包裝信號以及PRSV/5’LTR和ΔU3/3’LTR，能增強基因的表達、便于病毒包裝、利于目的基因整合至宿主細胞染色體。病毒的包裝采用四質粒系統(tǒng)，具有以反式方式提供病毒包裝和慢病毒載體的自滅活功能，加強實驗操作的安全性[10-11]。本研究通過構建攜帶hTERT基因的重組慢病毒載體、制備重組慢病毒，檢測攜帶hTERT基因的慢病毒對HeLa細胞的感染能力，及其介導外源hTERT基因在被感染細胞中的染色體整合和mRNA表達水平，這些工作對于進一步研究hTERT基因的功能及構建永生化細胞系具有重要意義。

[參考文獻]

[1] Osterhage J L, Friedman K L. Chromosome end maintenance by telomerase [J]. J Biol Chem, 2009,284(24):16061-16065.

[2]Shay J W, Wright W E. Telomerase therapeutics for cancer: challenges and new directions [J]. Nat Rev Drug Discov, 2006,5(7):577-584.

[3]Vidale P, Magnani E, Nergadze S G, et al. The catalytic and the RNA subunits of human telomerase are required to immortalize equid primary fibroblasts [J]. Chromosoma, 2012,121(5):475-488.

[4]Yao C L, Hwang S M. Immortalization of human mesenchymal stromal cells with telomerase and red fluorescence protein expression [J]. Methods Mol Biol, 2012,879:471-478.

[5]陳之鋒, 呂標, 鄭超群, 等. hTERT誘導永生化口腔黏膜上皮細胞株的建立 [J]. 中國口腔頜面外科雜志, 2013,11(2):91-96.

[6]杭化蓮, 張磊, 施曉雷, 等. 永生化人肝細胞系的建立及其生物學特性 [J]. 江蘇醫(yī)藥, 2011,37(22):2624-2627.

[7]Aubert G, Lansdorp P M. Telomeres and aging [J]. Physiol Rev, 2008,88(2)：557-579.

[8]陳小云, 張敏, 王磊, 等. 端粒酶在細胞永生化中的應用[J]. 中國獸藥雜志, 2013,47(4):53-57.

[9]Naldini L. Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells [J]. Curr Opin Biotechnol, 1998,9(5):457-463.

[10]Zufferey R, Dull T, Mandel R J, et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficientinvivogene delivery [J]. J Virol, 1998,72(12):9873-9880.

[11]Buchschacher G L Jr, Wong-Staal F. Development of lentiviral vectors for gene therapy for human diseases [J]. Blood, 2000,95(8):2499-2504.