袁 偉，方 杰，瓦慶彪，陳前明

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563099；2.成都市第二人民醫(yī)院 皮膚科，四川 成都 610017)

端粒酶活性增強可導致細胞永生化、腫瘤形成。內(nèi)源性端粒酶抑制基因PinX1(PIN2/TERF1 interacting, telomerase inhibitor 1)基因是在人類細胞中發(fā)現(xiàn)的一個能與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT(human telomerase reverse transcriptase)直接相互作用的端粒酶/端粒調(diào)控因子，能下調(diào)端粒酶活性，縮短端粒長度，進而誘導腫瘤細胞凋亡，被推測為潛在的抑癌基因。目前已發(fā)現(xiàn)PinX1在人類包括肝癌、膀胱癌、肺癌、鼻咽癌、食管癌等多種腫瘤中的表達明顯降低或無表達[1-3]，而且在皮膚腫瘤中已有研究表明端粒酶活性高于正常皮膚組織[4]。本研究旨在通過檢測PinX1、hTERT在基底細胞癌(basal cell carcinomas，BCC)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)中的表達，探討PinX1、hTERT在BCC、SCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 標本資料 實時定量PCR應(yīng)用新鮮組織標本，采集2012年3月至2013年3月遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院及成都第二人民醫(yī)院手術(shù)標本，包括BCC13例(男5例，女8例，年齡40～88歲，平均56.85±15.07歲)、SCC22例(男10例，女12例，年齡51～93歲，平均68.68±12.67歲)及正常皮膚組織15例(男性9例，女性6例，年齡22～65歲，平均39.66±11.85歲)。取材部位：頭、面、四肢、軀干。所有標本采集離體10 min內(nèi)置入凍存管內(nèi)，放入-80 ℃低溫冰箱保存。免疫組化石蠟標本為遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院及成都市第二人民醫(yī)院2008年12月至2012年6月明確診斷的病變組織石蠟標本。取材部位：頭、面、四肢、軀干。其中30例BCC(男11例，女19例，年齡40～84歲，平均65.33±11.91歲)、46例SCC(男21例，女25例，年齡41～95歲，平均66.63±11.99歲)及正常皮膚組織17例(男8例，女9例，年齡15～60歲，平均38.54±14.12歲)。研究對象選擇標準如下：①基底細胞癌及鱗狀細胞癌均有典型或較為典型的皮損，術(shù)前均未經(jīng)放療、光動力治療以及其它特殊治療，經(jīng)皮膚病理檢查證實具有其相應(yīng)的典型病理改變；②對照組正常皮膚為接受美容或整形外科手術(shù)的個體，均無免疫性疾病和系統(tǒng)性疾病。

1.2 主要實驗試劑 實時定量PCR主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒(大連TakaPa公司)、SYBR Green I嵌合熒光法試劑盒(大連TakaPa公司)、PinX1與hTERT引物及內(nèi)參還原磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物均由上海Sangon公司設(shè)計合成，引物序列(見表1)。免疫組化主要試劑：兔抗人PinX1多克隆抗體(美國Assay生物公司)、兔抗人TERT多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、PV-9000免疫組化染色試劑盒 (北京中杉金橋生物公司)、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。PinX1多克隆抗體工作液濃度為1∶75，hTERT多克隆抗體工作液濃度為1∶200。

表1 PinX1、hTERT及GAPDH引物序列

基因引物長度PinX1Forward: 5'-GGTGGTCTAAAG-GAAAGGGTTT-3'Reverse: 5'-ATGGGCAATCCAGTTGTCTT-3'127hTERTForward: 5'-CTCCCATTTCATCAGCAAGTTT-3'Reverse: 5'-CTTGGCTTTCAGGATGGAGTAG-3'96GAPDHForward: 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'Reverse: 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'258

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR ①提取總RNA，合成cDNA：取組織100 mg采用Trizol一步法提取組織內(nèi)總RNA。所提取的總RNA用紫外分光光度計測定A260/A280含量并檢測其純度，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。篩選所有比值在1.8～2.0且無降解的樣品，取2 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒說明合成cDNA。cDNA放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＂跀U增及電泳：以cDNA為模板，利用Bio-RAD熒光定量PCR儀(美國Bio-RAD公司)按照SYBR Green I嵌合熒光法試劑盒說明書檢測PinX1、hTERT基因mRNA在基底細胞癌、鱗狀細胞癌及正常皮膚組織中的表達。擴增反應(yīng)條件：PinX1 PCR：預(yù)變性95 ℃10 s，1個循環(huán)：變性95 ℃10 s，退火(復(fù)性)55 ℃30 s，40個循環(huán)；GAPDH PCR：預(yù)變性95 ℃10 s，1個循環(huán)；變性95 ℃10 s，退火60 ℃30 s，40個循環(huán)；hTERT PCR：預(yù)變性95 ℃10 s，1個循環(huán)；變性95 ℃10 s，退火60 ℃30 s，40個循環(huán)。采用2-△△ct法對有特異性擴增的目的基因進行相對定量。反應(yīng)結(jié)束后分析PCR擴增曲線及熔解曲線，并進行2%瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測擴增特異性。

1.3.2 免疫組化 石蠟標本4 μm連續(xù)切片。采用免疫組化SP法，行pH6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原，具體方法參照試劑盒說明書進行。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對照。PinX1免疫組化結(jié)果以胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性；hTERT免疫組化結(jié)果以胞核或(和)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。染色范圍以免疫染色最多的區(qū)域，每個標本在400倍圖像下等距隨機選10個視野，按一定順序計數(shù)500個細胞，計算陽性細胞率并評分：基本無染色為0分，淺棕黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分；著色細胞占計數(shù)細胞百分率≤5%為0分，6%～30%為1分，3l%～60%為2分，>61%為3分。評分=著色程度得分×著色細胞百分率得分。<2分為陰性(-)，≥2分為陽性(+)[5]。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，對實時定量PCR各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析；免疫組化實驗組與對照組之間陽性表達率比較采用2檢驗進行比較分析，兩樣本相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)檢驗，以α=0.05為檢驗標準。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR結(jié)果

2.1.1 總RNA純度和完整性 A260/A280樣本比值在1.8～2.0，提示總RNA純度良好；在紫外線燈下可見28S、18S和5S三條大小和比例合適的條帶，表明提取的總RNA無降解。

2.1.2 PinX1及hTERT mRNA的表達水平 PinX1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖在127bp處可見明顯的電泳條帶，hTERT基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖在96 bp處可見明顯的電泳條帶，GAPDH基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖在258bp處可見明顯的電泳條帶(見圖1)。

注：M為DNA Marker 2000；1、2、3為PinX1擴增片斷(127bp)；4、5、6為GAPDH擴增片斷(258bp)；7、8、9為hTERT擴增片斷(96bp)。 圖1 PinX1、GAPDH和hTERT電泳圖

2.1.3 PinX1及hTERT基因mRNA的相對表達量 BCC、SCC組織中PinX1 mRNA的相對表達量均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，BCC與SCC組織中PinX1 mRNA的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；BCC、SCC組織中hTERT mRNA的相對表達量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，BCC與SCC組織中hTERT mRNA的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2)。

組別例數(shù)PinX1hTERTBCC132.26±1.38*5.90±2.94*SCC222.68±1.71*6.28±4.01*Control154.25±2.021.62±0.99

注：*：與對照組相比，P<0.05。

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 BCC、SCC組織中PinX1蛋白的表達 PinX1蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于胞核，SP染色呈粗細不一的棕黃色顆粒。正常皮膚組織中PinX1蛋白呈陽性表達(見圖2A)?；准毎?、鱗狀細胞癌中，可見到PinX1蛋白呈不同程度的表達(見圖2B、2C)。兩組PinX1陽性表達率均明顯低于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(基底細胞癌與鱗狀細胞癌組織PinX1陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(2=0.241，P>0.05,見表3)。

表3 PinX1蛋白在皮膚腫瘤組織和正常皮膚組織中的表達

組別例數(shù)PinX12PBCC306(20.0)9.3930.002SCC466(13.04)14.2950.000Nor-mal1711(64.7)

注：A：PinX1蛋白在正常皮膚組織中的表達；B：PinX1蛋白在BCC組織中的表達；C：PinX1蛋白在SCC組織中的表達；D：hTERT蛋白在正常皮膚組織中的表達；E：hTERT蛋白在BCC組織中的表達；F：hTERT蛋白在SCC組織中的表達。 圖2 PinX1、hTERT蛋白在各組組織中的表達(SP ×100)

2.2.2 BCC、SCC組織中hTERT蛋白的表達 hTERT蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細胞核或(和)細胞漿中，SP染色呈棕黃色顆粒。正常組織中多數(shù)hTERT表達呈陰性(見圖2D)?；准毎?、鱗狀細胞癌中，hTERT蛋白均有表達(見圖2E、2F)，其陽性表達率均明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(基底細胞癌、鱗狀細胞癌之間hTERT蛋白陽性表達率差異均無統(tǒng)計學意義(2=0.163，P>0.05,見表4)。

表4 hTERT在皮膚腫瘤組織和正常皮膚組織中的表達

組別例數(shù)hTERT2PBCC3019(63.3)11.6750.001SCC4627(58.7)11.0050.001Nor-mal172(11.8)

2.2.3 PinX1與hTERT蛋白表達的相關(guān)性分析 通過對PinX1與hTERT蛋白在組織中的陽性表達及陰性表達例數(shù)進行Spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果表明：基底細胞癌組織中二者表達呈負相關(guān)(r=-0.439，P<0.05)；鱗狀細胞癌組織中二者表達呈負相關(guān)(r=-0.476，P<0.05)；基底細胞癌及鱗狀細胞癌兩種皮膚腫瘤中二者表達呈負相關(guān)(r=-0.460，P<0.05)。

3 討論

端粒酶能以自身RNA為模板合成端粒DNA，并加至端粒末端以維持端粒長度的穩(wěn)定，抵消因各種原因造成的端粒的縮短及不穩(wěn)定。正常人體細胞端粒酶活性缺乏，細胞分裂同時端粒就會相應(yīng)縮短，當端?？s短到一定長度時，保護染色體末端的功能喪失，最終導致細胞衰老或凋亡；而在腫瘤細胞中，端粒酶被重新活化，使端粒長度穩(wěn)定，細胞因此逃過死亡而無限增殖，導致腫瘤細胞永生化[6-8]。

人端粒酶的主要組成為：①人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT);②端粒酶相關(guān)蛋白(telomerase associated protein, TP);③人端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)。在端粒酶的活性起調(diào)控中，端粒酶催化亞單位TERT最為重要，是關(guān)鍵的限速酶，而端粒RNA及端粒酶相關(guān)蛋白均不能決定端粒酶活性[9]。hTERT為RNA依賴的DNA 聚合酶，可識別單鏈富含G的寡核苷酸引物，以其RNA組分的堿基為模板與端粒重復(fù)序列進行堿基互補配對，在合成、延伸堿基序列中起催化作用[10]。

作為內(nèi)源性端粒酶抑制基因，PinX1基因由7個外顯子組成，有兩種轉(zhuǎn)錄形式，分別編碼174個氨基酸和328個氨基酸[11]。其定位于8p23，該區(qū)域同時也是一個在多種人類腫瘤中發(fā)生高頻雜合缺失(loss of heterozygosity，LOH) 的區(qū)域。有體外實驗證據(jù)表明，PinX1與其端粒酶抑制結(jié)構(gòu)域TID可以與hTERT相互作用，下調(diào)端粒酶活性[11-12]。同時，PinX1還可依賴TERT結(jié)合端粒酶的RNA組分，阻斷端粒酶RNA，從而使其喪失活性，破壞其模板功能，從而抑制端粒酶活性[13-14]。

PinX1在正常人體組織內(nèi)廣泛存在，而在腫瘤組織中則低表達或者不表達[11]；hTERT在腫瘤組織中存在高表達，而在正常組織中低表達或不表達[15]。本實驗結(jié)果顯示PinX1在基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌組織中的表達水平明顯低于正常組(P<0.05)，部分低表達或不表達，提示作為內(nèi)源性端粒酶抑制基因，PinX1可能參與皮膚組織細胞端粒酶活性的下調(diào)，維持細胞的正常凋亡，抑制腫瘤的生長，由于PinX1的損傷或缺失，端粒酶在基底細胞癌、鱗狀細胞癌組織中活化，使細胞永生化腫瘤生長。hTERT在基底細胞癌、鱗狀細胞癌組織中的表達水平明顯高于正常組(P<0.05)，hTERT作為端粒酶的活性調(diào)控關(guān)鍵的限速酶，其在基底細胞癌、鱗狀細胞癌組織中呈高表達，提示端粒酶活性在基底細胞癌、鱗狀細胞癌及日光性角化病組織中可能強于正常皮膚組織，hTERT的高表達可能促進基底細胞癌、鱗狀細胞癌的發(fā)生?；准毎?、鱗狀細胞癌組織中PinX1表達和hTERT 表達呈負相關(guān)，推測二者可能存在著一定的拮抗，可能因為PinX1下調(diào)，hTERT不能被有效結(jié)合并抑制，致使端粒酶活性增強，端粒長度得到維持，因此細胞不能正常衰老或凋亡而無限增殖，從而導致腫瘤生長。

綜上所述，檢測PinX1和hTERT的表達可能對評價基底細胞癌、鱗狀細胞癌的發(fā)展有重要的臨床價值，PinX1、hTERT有可能成為基底細胞癌、鱗狀細胞癌新的檢測指標，而且通過調(diào)控PinX1、hTERT的表達可能成為治療基底細胞癌、鱗狀細胞癌的一條新途徑。

[參考文獻]

[1] 馬英玉,武良,李繼承.Pinx1表達與端粒酶活性及腫瘤的關(guān)系[J].細胞生物學雜志, 2008,30(4):472-474.

[2] 賴肖芬,申聰香,文忠，等. 端粒酶抑制因子PinX1基因在鼻咽癌細胞中的表達及作用效應(yīng)分析[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志, 2011,17(3):161-163.

[3] 左靜,王大虎,張祥宏，等.PinXl在食管鱗狀細胞癌中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系[J].中國老年學雜志, 2012,32(1):259-260.

[4] Chen Z，Smith K J，Skelton H G，et al．Telomerase activity in Kaposi's sarcoma，squamous cell carcinoma，and basal cell carcinoma[J].Exp Biol Med， 2001，226(8)：753-757.

[5] 張晉卿,梁虹,王珊珊，等.Survivin和COX-2在鮑溫病和皮膚鱗狀細胞癌中的表達及意義[J].中國皮膚性病學雜志, 2010,24(9):801-803.

[6] Grandin N，Charbonneau M. Protection against chromosome degradation at the telomeres[J].Biochimie， 2008，90(1)：41-59．

[7] Bianchi A, Shore D. How telomerase Reaches Its End: Mechanism of Telomerase Regulation by the Telomeric Complex [J]. Mol Cell, 2008,31(2):153-165.

[8] Rhyu M S. Telomeres, telomerase, and immortality[J]. J Natl Cancer Inst,1995,87(12):884-894.

[9] Marcia B， Christophe N. Regulation of Telomerase and Telomeres：Human Tumor Viruses Take Control [J]. J Natl Cancer Inst， 2008，100 (2)：98-108.

[10] Gillis A J, Schuller A P, Skordalakes E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT[J]. Nature, 2008,455(7213):633-637.

[11] Zhou X Z, Lu K P.The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent Atelomerase inhibitor[J]. Cell, 2001,107(3).347-359.

[12] Johnson F B. PinX1 the tail on the chromosome[J]. J Clin Invest， 2011，121(4)：1242-1244.

[13] Banik S S， Counter C M. Characterization of interactions between PinX1 and human telomerase subunits hTERT and hTR[J]. J Biol Chem， 2004，279(50)：51745-51748.

[14] Lin J, Blackburn E H.Nucleolar protein PinX1p regulates telomerase by sequestering its protein catalytic subunit in an inactive complex lacking telomerase RNA [J]. Genes Dev, 2004,18(4):387-396.

[15] Zang G , Miao L , Mu Y, et al. Adenoviral mediated transduction of adenoid cystic carcinoma by human TRAIL gene driven with hTERT tumor specific promoter induces apoptosis [J]. Cancer Biol Ther, 2009,8(10):966-972.