許 潔，汪 洋，楊孟雪，蔣智鋼，萬(wàn)齊友，庹芳旭，封校亞，俞 捷

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 重慶 400016；2. 遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院, 貴州 遵義 563099；3. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563099 )

基因芯片技術(shù)是20 世紀(jì) 90 年代迅速發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)，它在疾病發(fā)生機(jī)制和臨床診斷等許多生命科學(xué)領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用，具有快速、準(zhǔn)確、多樣性、微型化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[1-4]。目前，基因芯片技術(shù)在神經(jīng)毒理學(xué)中的應(yīng)用還屬于初始階段，本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選暴露仔鼠模型海馬組織的差異表達(dá)基因，擬在基因水平揭示Nonylphnol (NP) 引起仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低的可能作用機(jī)制。

結(jié)合在前期實(shí)踐過(guò)程中遇到的若干問(wèn)題，遵循對(duì)照長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶發(fā)展和生態(tài)文明建設(shè)的新要求，本文從頂層設(shè)計(jì)、系統(tǒng)治理、綠色發(fā)展、科技與制度改革創(chuàng)新、水生態(tài)文明意識(shí)培育五個(gè)方面探索提出對(duì)城市水生態(tài)文明建設(shè)的對(duì)策建議。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及染毒 選取清潔級(jí)Sprague Dawley大鼠性成熟個(gè)體，雄鼠15只，雌鼠30只，按雌：雄2：1同籠交配(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供：SCXK(渝)20070005)，獲取妊娠雌性SD鼠后隨機(jī)分為NP組與對(duì)照組，于妊娠第6天到出生后21 d灌胃NP和花生油, NP 純度99%(購(gòu)于東京化成株試會(huì)社)。

1.2.2 差異表達(dá)基因的篩選 原始數(shù)據(jù)用FastQC檢測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量，使用Tophat進(jìn)行“序列比對(duì)”，再由Cufflink系列軟件分析陰性對(duì)照組和miR-1254模擬體組的DEG。其中，以倍數(shù)變化(fold change，F(xiàn)C)表示單個(gè)基因表達(dá)變化的倍數(shù)。以q<0.05且|log FC|≥1考慮差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 樣品的合并 NP實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組21 d仔鼠累積取樣各10個(gè)，于盛有液態(tài)氮的金屬溶器中進(jìn)行樣品合并，放液氮罐中備用。

2.3.1.1 分子功能(molecular function)差異表達(dá)基因主要涉及的分子功能：結(jié)合活性(binding activity)有158個(gè)基因上調(diào)、催化活性(catalytic activity)有83個(gè)基因上調(diào)、核酸結(jié)合活性(nucleotide binding)有55個(gè)基因上調(diào)，嘌呤核苷酸結(jié)合活性(purine ribonucleotide binding)有50個(gè)基因上調(diào)等(見(jiàn)圖1)。

1.5 差異基因GO(Gene Ontology)分析 GO是基因及基因產(chǎn)物的功能分類體系，分為分子功能(Molecular Function)、生物過(guò)程(Biological Process)和細(xì)胞組成(Cellular Component)3個(gè)部分。

1.4 表達(dá)譜芯片雜交及掃描 芯片雜交與洗滌委托上海康成科技有限公司完成。大鼠表達(dá)譜芯片采用Roche NimbleGen(NimbleGen Systems, Inc., USA)的12x135K芯片，每張芯片可檢測(cè)26,419個(gè)基因，芯片晾干后，結(jié)果采用Axon GenePix 4000B 芯片掃描儀，掃描文件導(dǎo)入GenePix Pro 6.0分析軟件。

2 結(jié)果

2.1 腦組織RNA提取及質(zhì)量鑒定結(jié)果 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣本提取的總RNA，經(jīng)核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)，特定波長(zhǎng)的光密度值A(chǔ)260/A280比值在1.9～2.1，A260/A230 比值大于1.8，表明提取的總RNA無(wú)降解，符合實(shí)驗(yàn)要求，且mRNA總量達(dá)到芯片分析要求(見(jiàn)表1)。

表1壬基酚暴露和未暴露組腦組織RNA提取及質(zhì)量鑒定結(jié)果

組別OD260/280OD260/230濃度 (ng/μL)對(duì)照組2.042.351721.97處理組 2.062.282024.5

2.2 差異表達(dá)基因 暴露組與對(duì)照組共檢測(cè)26 419個(gè)基因，芯片結(jié)果有1 254個(gè)差異表達(dá)基因，其中619個(gè)基因上調(diào)，635個(gè)基因下調(diào)。與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)差異表達(dá)基因大致為幾方面：周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育基因，細(xì)胞增殖與分化，細(xì)胞凋亡，免疫應(yīng)答，炎癥反應(yīng)因子，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等方面。

2.3.1.3 細(xì)胞組成(cellular component) 表達(dá)上調(diào)基因的表達(dá)產(chǎn)物所涉及細(xì)胞成分：胞外區(qū)(extracellular region)有27個(gè)基因、高爾基體部分(Golgi apparatus part)有8個(gè)基因、中間纖維(intermediate filament)有5個(gè)等(見(jiàn)圖3)。

2.3 基因功能分類

2.3.1 上調(diào)基因功能分類

有一個(gè)大胡子照相師曾經(jīng)騎著一匹棗紅馬來(lái)我們村。他第一次來(lái)，我以為是您回來(lái)了。那天，我遠(yuǎn)遠(yuǎn)看見(jiàn)他，不知道怎么就跑上去，問(wèn)他認(rèn)不認(rèn)識(shí)一杭。我很希望他說(shuō)認(rèn)識(shí)。但他說(shuō)不認(rèn)識(shí)。還反問(wèn)我認(rèn)識(shí)嗎？不過(guò)，我還是很喜歡他，他有很粗很黑的胡子，看上去特別威風(fēng)。爸爸，您也要為我留一把大胡子。

1.3 總RNA的提取及鑒定 用TRIzol提取NP暴露組和對(duì)照組腦組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)0D值，要求A260/A280比值介于1.8～2.1,A260/A230 比值大于1.8。

2.3.2 下調(diào)基因功能分類

小兒急性上呼吸道感染是臨床常見(jiàn)的小兒疾病,可見(jiàn)于任何季節(jié),鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等是引起本病的主要病原菌,患兒臨床多表現(xiàn)為噴嚏、咽部充血、發(fā)熱等癥狀。

然后，飼料廠要注重生物安全。在不使用時(shí)做好密封，有效地控制害蟲(chóng)，防止灰塵收集系統(tǒng)中的灰塵再循環(huán)回到飼料中，并管理好整個(gè)工廠的人員移動(dòng)。

2.3.1.2 生物過(guò)程(biological process)表達(dá)上調(diào)基因參與的主要生物學(xué)過(guò)程：大分子代謝過(guò)程(macromolecule metabolic process)有102基因上調(diào)，細(xì)胞大分子代謝過(guò)程(cellular macromolecule metabolic process) 有92基因上調(diào),蛋白代謝過(guò)程(protein metabolic process)有62個(gè)基因上調(diào)等(見(jiàn)圖2)。

2.3.2.1 分子功能(molecular function)表達(dá)下調(diào)基因經(jīng)GO分析，分子功能主要分類：結(jié)合活性(binding activity)有266個(gè)基因下調(diào)、催化活性(catalytic activity)有153個(gè)基因下調(diào)、金屬離子結(jié)合活性(metalion binding)有95個(gè)基因下調(diào)、離子結(jié)合活性(ion binding)有95個(gè)基因下調(diào)，陽(yáng)離子結(jié)合活性(cation binding)有95個(gè)基因下調(diào)等(見(jiàn)圖4)。

圖1 差異表達(dá)上調(diào)基因分子功能的分類 圖2 差異表達(dá)上調(diào)基因參與的生物過(guò)程分析

圖3 差異表達(dá)上調(diào)基因表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞組成分析 圖4 差異表達(dá)下調(diào)基因的分子功能分類

2.3.2.2 生物過(guò)程(biological process)從下調(diào)表達(dá)基因參與的生物學(xué)過(guò)程分析結(jié)果來(lái)看，下調(diào)基因參與的主要生物學(xué)過(guò)程： 細(xì)胞代謝過(guò)程(cellular metabolic process)有179個(gè)基因下調(diào)，代謝過(guò)程(metabolic process) 有209個(gè)基因，氮化合物代謝過(guò)程(nitrogen compound metabolic process)有110個(gè)基因，細(xì)胞氮化合物代謝過(guò)程(cellular nitrogen compound metabolic process) 有108個(gè)基因，核苷堿基、核苷、核苷酸及核酸代謝過(guò)程(nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolic process)有100個(gè)基因，發(fā)育過(guò)程(developmental process)有88個(gè)基因等(見(jiàn)圖5)。

2.3.2.3 細(xì)胞組成(cellular component)表達(dá)下調(diào)基因的表達(dá)產(chǎn)物所涉及細(xì)胞成分：細(xì)胞內(nèi)(intracellular)有280個(gè)基因，細(xì)胞內(nèi)部分(intracellular part)有264個(gè)基因，細(xì)胞器(organelle)有231個(gè)基因，細(xì)胞器部分(intracellular organelle)有228個(gè)基因，膜結(jié)合細(xì)胞器(membrane-bounded organelle)有204個(gè)基因，細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)有203個(gè)基因等(見(jiàn)圖6)。

圖5 差異表達(dá)下調(diào)基因參與的生物過(guò)程分析 圖6 差異表達(dá)下調(diào)基因表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞組成分析

3 討論

胚胎期和哺乳期是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能形成期，外界有害因素的影響可導(dǎo)致腦功能嚴(yán)重缺損。有研究報(bào)道NP可導(dǎo)致對(duì)小鼠神經(jīng)毒性作用[5-6]，NP和雌二醇[7]或雙酚A[8]孕哺期聯(lián)合染毒能使猴和鼠子代行為發(fā)生改變，但有關(guān)NP影響腦發(fā)育的機(jī)制目前還不十分清楚。目前國(guó)外有報(bào)道將基因表達(dá)譜芯片分析技術(shù)引入環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的體外實(shí)驗(yàn)研究[9-11]，有關(guān)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物NP對(duì)仔鼠神經(jīng)發(fā)育影響的基因表達(dá)譜分析的研究報(bào)道較少，關(guān)于NP對(duì)5日齡子代睪丸以及腦組織的芯片表達(dá)譜的研究表明[12-13]：NP對(duì)發(fā)育中的腦組織有關(guān)酶類、神經(jīng)遞質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不利影響，也可通過(guò)激活caspase-3誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用表達(dá)譜芯片檢測(cè)兩組差異基因，根據(jù)篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因參與的信號(hào)通路，為我們進(jìn)一步有針對(duì)性的探索NP神經(jīng)毒性的機(jī)制研究提供方向。

GO分析即基因本體論分析，表達(dá)譜芯片篩選的差異表達(dá)基因通過(guò)GO分析，可得知差異表達(dá)基因主要功能。本實(shí)驗(yàn)的GO(Gene Ontology)分析顯示：差異表達(dá)基因主要涉及的分子功能有結(jié)合活性、金屬離子結(jié)合活性、催化活性、核酸結(jié)合活性等；參與的主要生物學(xué)過(guò)程有細(xì)胞大分子代謝過(guò)程, 細(xì)胞氮化合物代謝過(guò)程、核苷酸及核酸代謝過(guò)程、蛋白代謝過(guò)程；所涉及細(xì)胞成分包括胞外區(qū)、細(xì)胞器、高爾基體部分、細(xì)胞質(zhì)、中間纖維等。目前尚無(wú)有關(guān)NP及其它的內(nèi)分泌干擾物對(duì)成熟期仔鼠腦組織的基因表達(dá)譜的報(bào)道，故無(wú)借鑒資料進(jìn)行比較，只能對(duì)差異表達(dá)基因中，現(xiàn)已明確功能的部分基因及表達(dá)產(chǎn)物的相關(guān)蛋白進(jìn)行分析，對(duì)定位和功能不明的基因，暫不能進(jìn)行分析，但可為NP對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響機(jī)制的研究提供了極為重要的線索，隨著未知基因功能逐步明確，將對(duì)逐步弄清NP對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)分化發(fā)育的損傷機(jī)制具有重要的意義。

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