史棟梁， 史桂榮

(1河南省中醫(yī)院風(fēng)濕骨病科，河南 鄭州 450002； 2商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 商丘 476100)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種全身性的自身免疫疾病，以慢性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)。它的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已有多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和蛋白酶類參與[1]?；こ衫w維細(xì)胞(synovialfibroblasts，SFs)的活化及致炎因子的分泌是導(dǎo)致RA炎癥和組織破壞的直接機(jī)制[2]。MicroRNAs(miRNAs)是一類新型保守的非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于各種生物體中。多項(xiàng)研究表明，miRNA與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。miR-16是miRNAs家族的重要成員，近期研究證實(shí)，RA患者中miR-16的表達(dá)水平明顯增高，提示miR-16可能在RA的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[5]。因此，本研究以RASFs為對(duì)象，構(gòu)建miR-16過表達(dá)和低表達(dá)的RASFs模型，分析miR-16對(duì)RASFs增殖、侵襲及胞外基質(zhì)、炎癥因子水平的影響，為RA的防治提供新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料、試劑和儀器

人關(guān)節(jié)滑膜組織取自河南省中醫(yī)學(xué)院二附院關(guān)節(jié)外科行關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者，患者均簽署知情同意書，RA患者臨床診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

RNAiso Plus kit、PrimeScript? RT reagent kit、SYBR?PremixExTaqTMII kit、LipofectamineTMRNAiMAX、抗β-肌動(dòng)蛋白抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶3/13(matrix metalloproteinase 3/13，MMP3/13)抗體、抗IL-1β抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(Invitrogen)；iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀和激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad)；miR-16 mimic和miR-16 抑制劑(Thermo Scientific)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、MTT、DMSO、DMEM培養(yǎng)基、annexin V-FITC和PI(Sigma)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Binder)；流式細(xì)胞儀(Olympus)。

2 方法

2.1RASFs的培養(yǎng) 術(shù)中取出滑膜組織，立即于無菌條件下剪碎，2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化2 h后，離心收集細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至接近融合狀態(tài)后即可傳代，第3～8代用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞的分組及轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組(control)、脂質(zhì)體對(duì)照組(mock)、miR-16抑制劑組及miR-16mimic組。采用LipofectamineTM2000將miR-16mimic或miR-16抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，混勻后于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。

2.3RT-PCR 收集細(xì)胞，按試劑盒說明書提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，PCR擴(kuò)增。miR-16上游引物5’-TGC GGT AGC AGC ACG TAA AT-3’，下游引物5’-TGC AGG GTC CGA GGT AT-3’；MMP3上游引物5’-GGG TGA GGA CAC CAG CAT GA-3’，下游引物5’-CAG AGT GTC GGA GTC CAG CTT C-3’；MMP13上游引物5’-TTG AGG ATA CAG GCA AGA CT-3’，下游引物5’-TGG AAG TAT TAC CCC AAA TG-3’；IL-1β上游引物5’-ATC TCC TGC CAA CCC TAC A-3’，下游引物5’-CTT TCA GCT CAT ACG TGC C-3’；β-actin上游引物5’-GGT GTG ATG GTG GGT ATG GGT-3’，下游引物5’-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3’)。按照試劑盒的說明書進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃ 5 min，進(jìn)入循環(huán)，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。依據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.4MTT法測(cè)定RASFs增殖 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RASFs接種于96孔板，每孔200μL，含2×104個(gè)細(xì)胞，加入miR-16mimic或miR-16抑制劑混勻后培養(yǎng)48h，設(shè)置空白對(duì)照組；每孔加入20μLMTT溶液(5g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4h；棄上清，加入150μL二甲基亞砜，搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm處A值。

2.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基洗3次，將細(xì)胞懸液密度調(diào)整成2×108/L。預(yù)先將Matrigel用無血清培養(yǎng)基DMEM稀釋成1∶3濃度，均勻地鋪滿Transwell小室上室的聚碳酸酯膜，室溫放置1 h。在下部小室中加入500 μL含10% FCS的DMEM培養(yǎng)基，小室內(nèi)接種200 μL無血清細(xì)胞懸液，培養(yǎng)16 h 后取出Transwell膜，用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)穿過Transwell膜的細(xì)胞數(shù)。

2.6AnnexinV/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按操作說明書進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)，具體操作為：收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入1mL1×annexinV結(jié)合緩沖液，離心去上清，在加入200μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入10μLannexinV-FITC和5μLPI(5mg/L)，輕輕混勻，避光孵育30min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.7Western blotting 將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次；加入450 μL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，SDS-PAGE蛋白電泳；電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后加稀釋好的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，次日PBS 1次、TBST 2次洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h。洗膜后ECL發(fā)光，X光片顯影、定影、掃描儀掃描膠片。以β-actin作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組樣本間兩兩比較用單因素方差分析(ANOVA)及LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定

Mock組RASFs中miR-16表達(dá)水平較對(duì)照組無明顯變化，而miR-16 mimic和miR-16抑制劑組RASFs中miR-16的表達(dá)水平分別為2.49±0.19和0.21±0.05，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),見圖1。

Figure 1. The expression of miR-16 in RASFs determined by RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control.

2 miR-16對(duì)RASFs增殖和侵襲的影響

如圖2A所示，與對(duì)照組相比，mock組無顯著變化；而miR-16 mimic組可以抑制RASFs的增殖，其A值為0.31±0.07，miR-16抑制劑組則可促進(jìn)RASFs的增殖，其A值為1.39±0.19，均有顯著差異(P<0.05)。細(xì)胞侵襲結(jié)果如圖2B所示，與對(duì)照組相比，mock組無顯著變化；而miR-16 mimic組可以抑制RASFs的侵襲，穿膜細(xì)胞數(shù)為47±5(P<0.05)，miR-16抑制劑組則可促進(jìn)RASFs的侵襲，穿膜細(xì)胞數(shù)為149±13，均顯著差異(P<0.05)。

3 miR-16對(duì)RASFs凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示左下區(qū)細(xì)胞簇為活細(xì)胞，左上區(qū)細(xì)胞簇為壞死細(xì)胞，右下區(qū)及右上區(qū)細(xì)胞簇分別為早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞。與對(duì)照組相比，mock組、miR-16 mimic及miR-16抑制劑組的總細(xì)胞凋亡率均無顯著差異(P>0.05),見圖3。

4 miR-16對(duì)RASFs中MMPs表達(dá)水平的影響

將miR-16 過表達(dá)轉(zhuǎn)染RASFs，RT-PCR分析表明，miR-16 mimic可明顯降低RASFs中MMP3及MMP13 mRNA的水平,見圖4A、B，同時(shí)MMP3及MMP13蛋白的水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4C。上述結(jié)果表明，miR-16可抑制RASFs中MMP3和MMP13的表達(dá)，提示其在緩解ECM的降解中具有重要作用。

Figure 2. Effects of miR-16 on the proliferation (A) and invasion (B) of RASFs. HPF: high-power field. Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs control.

Figure 3. Effect of miR-16 on the apoptosis of RASFs.

5 miR-16對(duì)RASFs中炎癥因子的影響

與對(duì)照組相比，miR-16 mimic可明顯降低RASFs中IL-1β mRNA的水平，同時(shí)伴隨其蛋白表達(dá)水平的下調(diào)；而miR-16抑制劑則可顯著提高IL-1β的表達(dá)水平，見圖5。

Figure 4. Effect of miR-16 on the levels of MMPs expression in RASFs.A： relative mRNA level of MMP-3; B: relative mRNA level of MMP-13； C: protein expression of MMP3 and MMP13. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control.

Figure 5. Effect of miR-16 on the mRNA (A) and protein (B) levels of IL-1β in RASFs.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control.

討 論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為病理特征的自身免疫性疾病，研究顯示RASFs的異常增生與RA的發(fā)生有著密切聯(lián)系。而miRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)控生物體基因表達(dá)的重要分子，參與多種免疫細(xì)胞的活化和分化過程[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，與正?；颊呦啾龋琑A患者血漿和滑膜液中miR-16濃度均顯著上升，其值分別為1.3×103pmol/L和1.5×102pmol/L[7]，提示miR-16可能在RA的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，多種miRNAs對(duì)RASFs增殖、侵襲均有影響。張曉萍等[8]發(fā)現(xiàn)miR-146a轉(zhuǎn)染可顯著抑制RASFs的增殖；Long等[9]發(fā)現(xiàn)miR-155也可抑制RASFs的增殖和侵襲。與上述研究結(jié)果相一致，本研究結(jié)果表明，miR-16 mimic能顯著抑制體外培養(yǎng)RASFs的增殖和侵襲，而miR-16抑制劑則可顯著促進(jìn)RASFs的增殖和侵襲。提示miR-16通過抑制RASFs的增殖和侵襲從而緩解RA的發(fā)生。在骨肉瘤中，miR-16 通過靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖[10]；在非小細(xì)胞肺癌中，miR-16 通過靶向肝癌衍生生長(zhǎng)因子抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。我們推測(cè)在RASFs增殖、侵襲過程中，miR-16可能通過抑制某一靶基因的表達(dá)進(jìn)而抑制RASFs增殖、侵襲，但miR-16在RASFs中調(diào)控靶基因還需要進(jìn)一步研究。此外，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明miR-16對(duì)RASFs的凋亡沒有顯著影響，提示miR-16抑制RASFs的增殖并不是通過影響細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

MMPs是一族鋅離子依賴性的內(nèi)源性蛋白水解酶，它能降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，直接降解軟骨和骨質(zhì)，從而造成RA病理過程中的骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)破壞[12]。MMPs家族中MMP3/13是導(dǎo)致軟骨降解的蛋白酶，其對(duì)RA的破壞作用主要在于軟骨活化后可導(dǎo)致軟骨連結(jié)蛋白、纖維連接素以及多種膠原酶等蛋白酶的降解[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-16 mimic可下調(diào)RASFs中MMP3及MMP13的表達(dá)水平，而miR-16抑制劑可上調(diào)RASFs中MMP3及MMP13的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道，MMP的表達(dá)水平與RASFs的增殖和侵襲有著密切聯(lián)系[14]。因此，我們推測(cè)miR-16可能通過下調(diào)MMP3及MMP13的表達(dá)水平來抑制RASFs的增殖和侵襲。

TNF-α和IL-1β在RA發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，這2種細(xì)胞因子通過刺激RASFs增生，分泌IL-6、趨化因子以及基質(zhì)蛋白酶和前列腺素等效應(yīng)分子，從而造成關(guān)節(jié)損害[15]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-155可能通過抑制miR-155靶基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制RASFs增殖及IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮抑制RA滑膜炎癥的作用[8]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-16 mimic可下調(diào)RASFs中IL-1β的表達(dá)水平，而miR-16抑制劑可上調(diào)RASFs中IL-1β的表達(dá)。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活化可增加IL-1的表達(dá)水平，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中MMPs和前列腺素PGE2的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制IV型膠原及蛋白多糖的合成，還可調(diào)控軟骨結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)[16]，因此，我們推測(cè)miR-16可能是通過抑制NF-κB的表達(dá)抑制RASFs增殖、侵襲及炎癥細(xì)胞因子的分泌。

綜上所述，miR-16在RA的發(fā)病中起著重要作用，除了抑制RASFs的增殖、侵襲外，還可抑制MMP3/13以及IL-1β的表達(dá)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Isozaki T, Rabquer BJ, Ruth JH, et al. ADAM-10 is overexpressed in rheumatoid arthritis synovial tissue and mediates angiogenesis[J]. Arthritis Rheum, 2013, 65 (1): 98-108.

[2]HuberLC,DistlerO,TarnerI,etal.Synovialfibroblasts:keyplayersinrheumatoidarthritis[J].Rheumato-logy(Oxford),2006,45(6):669-675.

[3] Stanczyk J, Ospelt C, Karouzakis E, et al. Altered expression of microRNA-203 in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and its role in fibroblast activation[J]. Arthritis Rheum, 2011, 63(2):373-381.

[4]NidererF,TrenkmannM,OspeltC,etal.Down-regulationofmicroRNA-34ainrheumatoidarthritissynovialfibroblastspromotesapoptosisresistance[J].ArthritisRheum, 2012, 64(6):1771-1779.

[5] Furer V, Greenberg JD, Attur M, et al. The role of microRNA in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases[J]. Clin Immunol, 2010, 136(1):1-15.

[6]Duroux-RichardI,PresumeyJ,CourtiesG,etal.MicroRNAsasnewplayerinrheumatoidarthritis[J].JointBoneSpine, 2011, 78(1):17-22.

[7] Murata K, Yoshitomi H, Tanida S, et al. Plasma and synovial fluid microRNAs as potential biomarkers of rheumatoid arthritis and osteoarthritis[J]. Arthritis Res Ther, 2010, 12(3):R86.

[8] 張曉萍, 李 茹, 王世瑤, 等. 微小RNA-146a對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜成纖維細(xì)胞抑制作用的研究 [J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志, 2010, 14(4): 220-222.

[9] Long L, Yu P, Liu Y, et al. Upregulated microRNA-155 expression in peripheral blood mononuclear cells and fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis [J]. Clin Dev Immunol, 2013, 2013: 296139.

[10]ChenL,WangQ,WangGD,etal.miR-16inhibitscellproliferationbytargetingIGF1RandtheRaf1-MEK1/2-ERK1/2pathwayinosteosarcoma[J].FEBSLett, 2013, 587(9): 1366-1372.

[11] Ke Y, Zhao W, Xiong J, et al. Downregulation of miR-16 promotes growth and motility by targeting HDGF in non-small cell lung cancer cells [J]. FEBS Lett, 2013, 587(18): 3153-3157.

[12]BlasioliDJ,MatthewsGL,KaplanDL,etal.ThedegradationofchondrogenicpelletsusingcoculturesofsynovialfibroblastsandU937cells[J].Biomaterials, 2014, 35(4):1185-1191.

[13] Yoon HY, Lee EG, Lee H, et al. Kaempferol inhibits IL-1β-induced proliferation of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and the production of COX-2, PGE2and MMPs[J]. Int J Mol Med, 2013, 32(4):971-977.

[14]TolboomT,PietermanE,VanderLaanW,etal.Invasivepropertiesoffibroblast-likesynoviocytes:correlationwithgrowthcharacteristicsandexpressionofMMP-1,MMP-3,andMMP-10[J].AnnRheumDise, 2002, 61(11):975-980.

[15] Hu W, Xia LJ, Chen FH, et al. Recombinant human endostatin inhibits adjuvant arthritis by down-regulating VEGF expression and suppression of TNF-α, IL-1β production [J]. Inflamm Res, 2012, 61(8):827-835.

[16]PelletierJP,Martel-PelletierJ,AbramsonSB.Osteoarthritis,aninflammatorydisease:potentialimplicationfortheselectionofnewtherapeutictargets[J].ArthritisRheum, 2001, 44(6): 1237-1247.