李 新， 姜 黎， 楊 杪， 吳玉文， 孫蘇欣， 孫家忠

(武漢大學中南醫(yī)院1內分泌科, 2綜合科, 湖北 武漢 430071)

現有研究表明，脂肪組織已經不僅僅是胰島素作用的靶器官與能量儲備組織，而是具有多種生物學功能的內分泌器官。脂肪細胞或脂肪組織分泌的活性分子被稱為脂肪因子，參與體內糖脂代謝、炎癥反應、動脈粥樣硬化、胰島素信號轉導以及胰島β細胞功能調控等多個病理生理過程，成為聯系肥胖與2型糖尿病的重要因素。胰島素抵抗是一個慢性亞臨床炎癥過程，腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6 等多種炎癥因子可以降低機體對胰島素的敏感性[1]。

C1q/TNF相關蛋白3(C1q/TNF-relatedprotein3,CTRP3)是新近發(fā)現的一種脂肪因子，與脂聯素同屬C1q/TNF超家族，具有降糖、抗炎、抑制肝糖異生、促進內皮細胞增殖與遷移等效應[2-5]。但是CTRP3對脂肪組織胰島素敏感性的效應目前并不清楚。因此，本研究通過體外培養(yǎng)3T3-L1脂肪細胞，以軟脂酸(palmicacid,PA)誘導胰島素抵抗的3T3-LI脂肪細胞模型，觀察CTRP3對胰島素抵抗的脂肪細胞葡萄糖攝取率、TNF-α及IL-6表達、葡萄糖轉運子4(glucosetransporter4,GLUT-4) 表達等的效應，探討CTRP3對脂肪細胞胰島素敏感性的調節(jié)效應及可能機制。

材 料 和 方 法

1 細胞與試劑

小鼠3T3-L1前脂肪細胞(來源于美國菌種保藏中心，購自中國科學院上海生命科學研究院)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清、牛血清白蛋白、0.25%胰蛋白酶、青/鏈霉素、異丁基-甲基-黃嘌呤(IBMX)和油紅O(Sigma)；地塞米松(dexmethasone,DEX)、KRP緩沖液(131.2mmol/L NaCl、4.71 mmol/L KCl、2.47 mmol/L CaCl2、2.48 mmol/L Na3PO4、1.24 mmol/L MgSO4，10 mmol/L HEPES，pH 7.4)、2-脫氧-[3H]-葡萄糖(武漢楷倫化學新材料有限公司)；重組人胰島素(諾和公司)；重組CTRP3蛋白(BioVendor)；小鼠TNF-α及IL-6 ELISA檢測試劑盒(武漢中幟生物科技有限公司)；葡萄糖試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)；Trizol(Promega)；熒光定量PCR試劑盒(Invitrogen)；兔抗小鼠GLUT-4及β-actin抗體(Santa Cruz)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(北京中山公司)；ECL試劑盒(Pierce)。

2 細胞培養(yǎng)及誘導分化

將3T3-L1前脂肪細胞接種于培養(yǎng)板，在37 ℃、5%CO2的條件下，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞融合48 h后，加入含有IBMX(0.5 mmol/L)、DEX(0.25 mmol/L)及人胰島素(1 μmol/L)的培養(yǎng)液，48 h后換為含胰島素(1 μmol/L)的培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h，隨后以含有10%的胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h換液1次，誘導分化8～12 d后90%以上3T3-L1細胞呈脂肪細胞表型時可用于實驗。

3 構建 3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型, 鑒定, 干預與分組

將誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞，以含有0.2%無游離脂肪酸的BSA的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，再換為含有胰島素(0.1 μmol/L)、1%無游離脂肪酸的BSA以及PA(1.0 mmol/L)的DMEM培養(yǎng)24 h，構建胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞模型。通過比較葡萄糖消耗量及葡萄糖攝取率來反映PA誘導后3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗情況。

將上述細胞分為正常對照(normal control,NC)組、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)組及CTRP3干預(CTRP3 intervention,CI)組，CI組又分不同濃度(10、50、250、1 250 μg/L)重組CTRP3蛋白干預12 h及250 μg/L CTRP3干預不同時間(2、6、12、24 h)等亞組。分別以含有不同濃度重組CTRP3蛋白的DMEM高糖(25.0 mmol/L)培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時間，用于進一步檢測。

4 主要方法

4.1葡萄糖消耗量 收集上述培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液，用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖濃度，計算其消耗量，公式為：干預前培養(yǎng)液中高糖濃度(25.0 mmol/L)-干預后各組葡萄糖濃度;每組重復實驗3次，取其平均值。

4.2炎癥因子分泌的檢測 取上述細胞培養(yǎng)液，以酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測上清中的TNF-α及IL-6含量，按照說明書進行操作。

4.3葡萄糖轉運實驗 將上述細胞以KRP緩沖液洗3次，再以含有胰島素(10 nmol/L)的KRP緩沖液孵育30 min，加入含2-脫氧-[3H]-葡萄糖(1.85×104Bq/mL)的KRP緩沖液孵育10 min，然后以預冷的含10 mmol/L葡萄糖的PBS液快速洗滌3次終止反應，再加入1 mL NaOH(0.1 mmol/L)，2 h后取0.2 mL細胞裂解液于閃爍液中避光放置12 h，用液體閃爍計數器進行計數。另設一組細胞加入細胞松弛素B(10 μmol/L)作為對照，所有數據減去該值，作為各組葡萄糖攝取率。

4.4實時熒光定量PCR檢測炎癥因子及GLUT-4mRNA的表達Trizol法提取總RNA，RT-PCR擴增目的基因。PCR引物由上海賽百盛公司合成，序列如下：IL-6正義鏈5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，反義鏈5’-CAGAATTGCCATTGCACAAC-3’;TNF-α正義鏈 5’-ACGGCATGGATCTCAAAGAC-3’，反義鏈5’-CGGCAGAGACCACCTTGAACT-3’；GLUT-4：正義鏈 5’-CCCCGCTGGAATGAGGTTTTTGAGGTGAT-3’，反義鏈5’-CAGACAGGGGCCGAAGATTGGGAGACAGT-3’;β-actin正義鏈 5’-ACACCCGCCACCAGTTCGC-3’，反義鏈5’-TCTCCCCCTCATCACCCACAT-3’。反應參數：預變性95 ℃ 15s；三步法PCR：95 ℃ 15s, 58 ℃ 10s，擴增45個循環(huán)；72 ℃ 45s。

4.5Western blotting檢測GLUT-4蛋白的表達 提取總蛋白，取15 μL樣品經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移到PVDF膜上，將轉印后的PVDF膜用兔抗小鼠GLUT-4抗體(1∶1 000)和抗β-actin抗體(1∶1 000)孵育，4℃搖床上過夜；然后以0.2%吐溫/PBS洗滌膜3次，每次10 min；再以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(Ⅱ抗)孵育膜，37 ℃搖床振蕩1 h，用0.2%吐溫/PBS洗滌膜3次，每次10 min；然后將膜浸于ECL中，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸，1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好放入X光片夾中，在暗室中曝光、顯影和定影。對膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的灰度值，以GLUT-4條帶與β-actin條帶的灰度比值表示其蛋白相對表達量。

5 統(tǒng)計學處理

數據以均數±標準差 (mean±SD) 表示，采用SPSS 18.0軟件包進行分析, 組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 CTRP3 對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響

與NC組相比，IR組葡萄糖消耗量顯著下降[(17.3±1.2) mmol/Lvs(8.6±0.7)mmol/L，P<0.01]，提示其存在明顯胰島素抵抗；與IR組相比，CI組隨干預濃度增加(10、50、250、1 250 μg/L)，葡萄糖消耗量分別增加22.1%、42.9%、76.6%及80.5%(均P<0.01)；10、50及250 μg/L干預組之間相比差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，1 250 μg/L與250 μg/L干預組之間相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1重組CTRP3蛋白對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響

Table 1. The impact of recombinant CTRP3 protein on the glucose consumption of insulin resistant 3T3-L1 adipocytes (Mean±SD.n=9)

GroupCTRP3 content ( μg/L)Palmic acid(mmol/L)Insulin(μmol/L)Glucose consumption(mmol/L) NC000.117.30±1.91 IR01.00.18.56±0.73??CI 1101.00.110.44±0.88??#CI 2501.00.112.22±1.30??##CI 32501.00.115.12±1.83??##CI 41 2501.00.115.45±1.81?##

NC:normalcontrol;IR:insulinresistance;CI:CTRP3intervention.*P<0.05,**P<0.01 vsNCgroup;#P<0.05,##P<0.01 vsIRgroup.

2 CTRP3對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率的影響

2.1CTRP3對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率的劑量-效應關系 將IR組葡萄糖攝取率設為1，較NC組下降了57.9%(P<0.01);與IR組相比，CI組不同濃度CTRP3(10、50、250、1 250 μg/L)干預12 h使胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率分別增加39.0%、68.0%、108.0%及111.0%(均P<0.01)。10、50及250 μg/L CTRP3干預組之間相比差異也有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，1 250 μg/L與250 μg/L干預組之間相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示干預時間為12 h的條件下，250 μg/L CTRP3對脂肪細胞葡萄糖攝取率的作用接近最大化，見表2。

2.2CTRP3對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率的時間-效應關系 以250μg/LCTRP3處理胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞，進一步觀察其時間-效應關系。結果顯示，CTRP3干預2、6、12、24h葡萄糖攝取率分別增加了23.0%、79.0%、109.0%及114.0%(均P<0.01)；CTRP3干預2、6、12h葡萄糖攝取率均較前一時點明顯增加(均P<0.01)，干預24h與12h相比，葡萄糖攝取率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示干預濃度為250μg/L的條件下，CTRP3干預12h對脂肪細胞葡萄糖攝取率的效應接近最大化，見表3。

表2 重組CTRP3蛋白對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率的劑量-效應關系

**P<0.01vsCTRP3 content 0 μg/L group.

表3 重組CTRP3蛋白對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率的時間-效應關系

**P<0.01vsCTRP3 content 0 h group.

3 CTRP3對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞炎癥因子表達的影響

與NC組相比，IR組上清中TNF-α及IL-6濃度分別增加了58.6%及51.8%(均P<0.01)，其mRNA相對表達量分別增加了92.0%及62.0%(均P<0.01)； 250 μg/L的CTRP3干預12 h，其上清中的TNF-α及IL-6濃度較IR組分別降低17.4%及17.1%(均P<0.01)，其mRNA表達分別較對照組降低26.0%及18.9%(均P<0.01)，見圖1、2。

Figure 1. The impact of CTRP3 on the release of TNF-α and IL-6 in the insulin resistant 3T3-L1 adipocytes with different treatments.Mean±SD.n=9.**P<0.01 vs NC group；## P<0.01 vs IR group.

Figure 2. The relative mRNA expression of TNF-α, IL-6 and GLUT-4 in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments.Mean±SD.n=9.** P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs IR group.

4 CTRP3對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞GLUT-4 mRNA及蛋白表達的影響

與NC組相比，IR組GLUT-4 mRNA及蛋白相對表達量分別降低了48.0%及46.0%(均P<0.01)；250 μg/L CTRP3干預12 h，其GLUT-4 mRNA及蛋白表達水平較IR組分別增加61.5%及55.6%(均P<0.01)，這可能是CTRP3干預導致葡萄糖攝取率增加的直接原因，見圖2、3。

討 論

脂肪組織及脂肪因子與胰島素抵抗及2型糖尿病關系密切，脂肪組織既是胰島素作用的重要靶器官，又通過分泌多種脂肪因子、細胞因子、炎癥因子等調節(jié)胰島素敏感性，成為連接肥胖與2型糖尿病的重要因素。目前已經發(fā)現了瘦素、脂聯素、抵抗素、內臟脂肪素等多種脂肪因子，并且還不斷有新的脂肪因子被報道。脂聯素是目前研究最為廣泛的脂肪因子之一，具有增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用，其血漿濃度與胰島素抵抗及2型糖尿病密切相關。但令人意外的是敲除脂聯素基因的動物模型僅僅表現出輕度代謝異常，提示體內可能還存在其它與脂聯素功能重疊的代謝調節(jié)因子[6]。正是在探索上述因子的研究中發(fā)現了C1q/TNF-相關蛋白1-15(CTRP1-15)，其中與糖脂代謝關系較為密切的是CTRP3。相關研究表明CTRP3具有改善整體血糖代謝的作用，其機制可能與抑制肝糖輸出有關，但是CTRP3對胰島素抵抗的作用并不清楚。因此，本研究通過構建脂肪細胞胰島素抵抗模型，給予重組CTRP3蛋白干預，觀察其對脂肪細胞葡萄糖攝取率的效應，并初步探討炎癥在其中的作用。

Figure 3. The relative protein expression of GLUT-4 in the insulin resistant 3T3-L1 adipocytes with different treatments.Mean±SD.n=9. ** P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs IR group.

本研究通過軟脂酸構建胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞模型，結果顯示軟脂酸培養(yǎng)后3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率及葡萄糖消耗量較對照組均顯著降低，提示軟脂酸培養(yǎng)的脂肪細胞存在明顯胰島素抵抗。以不同濃度(10、50、250、1 250 μg/L)重組CRTP3蛋白干預12 h，結果發(fā)現隨CTRP3濃度增加，脂肪細胞葡萄糖消耗量及葡萄糖攝取率均顯著增加，250 μg/L可能為其最佳作用濃度。進一步對CTRP3作用的時間-效應關系研究發(fā)現，隨CTRP3作用時間(2、6、12、24 h)的增加，脂肪細胞葡萄糖消耗量及葡萄糖攝取率均明顯增加，12 h時其作用已趨于最大。這些結果提示脂肪因子CTRP3在一定范圍內具有時間、劑量依賴性地促進脂肪細胞利用葡萄糖，改善其胰島素敏感性的效應。

為進一步探討CTRP3改善胰島素抵抗的脂肪細胞胰島素敏感性的機制，本研究觀察了250 μg/L重組CTRP3蛋白對脂肪細胞炎癥因子TNF-α與IL-6 mRNA表達及分泌量的影響。結果顯示CTRP3可以顯著降低TNF-α、IL-6 mRNA表達水平及蛋白分泌量，提示CTRP3可能通過下調脂肪細胞炎癥因子表達改善其胰島素敏感性。Kopp等[3]的研究表明CTRP3可以抑制脂多糖(LPS)、游離脂肪酸(十二烷酸)以及Toll樣受體配體等誘導的脂肪細胞及單核細胞炎癥因子表達，與本研究結果類似；而下調CTRP3的表達則導致脂肪細胞單核細胞趨化蛋白-1表達增多、脂聯素水平下降，以及脂肪細胞內脂滴體積及甘油三酯含量減少，即誘導成熟脂肪細胞轉化為非成熟細胞，誘發(fā)炎癥反應，提示CTRP3在調節(jié)脂肪細胞炎癥反應中具有重要作用，但該研究并未觀察CTRP3對脂肪細胞胰島素敏感性的效應。

炎癥因子可能通過多種機制損害胰島素信號轉導，導致胰島素抵抗。炎癥信號通路主要包括IκK/ NF-κB(核因子κB抑制物激酶/核因子κB)途徑 、JNK(c-Jun氨基末端激酶)途徑、SOCS(細胞因子信號抑制物)-3通路等。IκK是NF-κB炎癥信號通路的關鍵成分，同時又是胰島素受體和IRS(胰島素受體底物) 的絲氨酸磷酸化激酶，可以催化IRS 307 位的絲氨酸磷酸化，導致正常的酪氨酸磷酸化減少，抑制胰島素受體與IRS 的結合，損害胰島素信號轉導[7]；JNK 屬于促分裂原活化蛋白激酶中的一個途徑, 也可通過磷酸化IRS 307 位的絲氨酸,損害胰島素信號轉導[8]；SOCS-3是細胞因子激活途徑的負反饋調節(jié)物，通過競爭性抑制IRS酪氨酸磷酸化，減少IRS與磷脂酰肌醇3-激酶的調節(jié)亞單位p85 的結合，以及通過泛素介導的IRS降解等機制損害胰島素信號轉導[9]，最終引起葡萄糖轉運子(glucose transporter,GLUT)表達下調，葡萄糖轉運減少，導致葡萄糖利用率下降，出現胰島素抵抗。本研究發(fā)現，CTRP3干預后，隨炎癥因子表達水平下降，脂肪細胞GLUT-4基因及蛋白表達水平均增加，這可能是脂肪細胞葡萄糖利用率增加的直接原因，也進一步提示CTRP3具有改善3T3-L1脂肪細胞胰島素敏感性的作用。

總之，本研究表明新的脂肪因子CTRP3具有改善脂肪組織胰島素敏感性的效應，其機制可能與下調脂肪細胞炎癥因子表達，改善胰島素信號轉導，增加葡萄糖轉運子表達等有關，提示CTRP3可能是胰島素抵抗及2型糖尿病防治研究的新的分子靶點。但是，CTRP3下調脂肪細胞炎癥因子表達的信號機制以及CTRP3對脂肪細胞胰島素信號通路的直接效應本研究并未涉及，尚需要進一步研究。

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