周彥希， 彭 成， 萬 峰， 曹小玉， 肖麗萍， 劉建林， 賀 抒， 杜巧輝， 龔小紅

(1成都中醫(yī)藥大學， 2中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 610075)

廣藿香油(patchoulioil)為唇形科植物廣藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth. 的干燥地上部分經(jīng)水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油[1]，是廣藿香的主要藥用成分。該成分具有抗細菌[2]、刺激胃腸分泌[3]、抗真菌、抗病毒、抗瘧原蟲、保護腸屏障功能、調(diào)節(jié)胃腸運動功能、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、止咳化痰、鎮(zhèn)吐等[4]廣泛藥理作用，但有關(guān)其解熱作用尚未見報道。本教研室前期實驗研究發(fā)現(xiàn)廣藿香油具有廣譜抗菌活性，并具有極強的抗菌效力。基于此，本實驗復制大腸桿菌內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱模型，觀察廣藿香油對家兔體溫的影響，并測定家兔血清中內(nèi)生致熱原白細胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α (TNF-α)含量及下丘腦中的中樞發(fā)熱介質(zhì)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)含量，旨在探討廣藿香油對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔的解熱作用及其解熱機制。

材 料 和 方 法

1 材料、動物和實驗分組

廣藿香，購自湛江雷州市，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李敏老師鑒定，為唇形科植物廣藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分，炮制后采用水蒸氣蒸餾法提取廣藿香油，使用時用0.5% 吐溫80配成廣藿香油乳。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS; Sigma)；注射用賴氨匹林(lysine acetylsalicylate for injection, LAI;揚州一洋制藥有限公司)；雙黃連注射液(Shuanghuanglian injection,SI;河南福森藥業(yè)有限公司)；Rabbit cAMP ELISA Kit、Rabbit TNF-α ELISA Kit、Rabbit IL-1β ELISA Kit和Rabbit PGE2ELISA Kit購自R&D。

電子天平(上海天平儀器廠，JA-2603)；OMRON電子體溫計(歐姆龍有限公司，MC-347)；離心機(Thermo Scientific, Legend Micro 17R)；酶標儀(Thermo Scientific, Varioskon Flash)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司，101-3-BS-Ⅱ)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ5200E型)。

雄性普通級家兔，體重(2.0±0.5)kg，由成都中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心提供，許可證編號為SCXK(川)2008-11。將家兔于實驗室飼養(yǎng)3 d，使其適應環(huán)境。分別在實驗前2 d及實驗當天晨測家兔肛溫，選擇3次肛溫值在38.5～39.5 ℃之間，波動不超過0.5 ℃者用于實驗。取實驗當天晨測肛溫為基礎體溫。根據(jù)實驗當天體重及基礎體溫值均分為7組，分別為空白對照組、模型對照組、西藥陽性組、中藥陽性組及廣藿香油高、中、低(2%、1%、0.5%)3個劑量組，每組6只。

2 方法

2.1復制LPS致家兔發(fā)熱模型 用無熱原的生理鹽水將精制的LPS稀釋成2 mg/L，除空白對照組外，其余各組均按1 mL/kg經(jīng)家兔左耳的耳緣靜脈注射LPS?？瞻讓φ战M按1 mL/kg耳緣靜脈注射無熱原生理鹽水。

2.2給藥LPS注射0.5h后，按以下方式順次經(jīng)家兔右耳的耳緣靜脈注射給藥：空白對照組：0.5% 吐溫80 1mL/kg；模型對照組：0.5% 吐溫80 1mL/kg；西藥陽性組：LAI1mL/kg；中藥陽性組：SI每只0.5～1mL；廣藿香油高、中、低劑量組：廣藿香油乳高、中、低(2%、1%和0.5%)1mL/kg。

2.3體溫測定 分別測定給藥后0.5 h、1 h、1.5 h、2.5 h、3.5 h、4.5 h和5.5 h(相當于造模后1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h)家兔的肛溫，比較不同時點肛溫與基礎肛溫之差值(ΔT)為體溫變化的指標。

2.4樣品采集與檢測 造模后3h耳緣靜脈取血3mL，靜止1～2h，離心(1 400×g, 15min)，取上清液，按試劑盒說明書測定IL-1β和TNF-α含量。于末次測量體溫后，立即斷頭處死家兔，取出全腦，在冰浴下于視交叉與灰結(jié)節(jié)之間取出下丘腦，縱向切成2等份，取1份稱重，放入盛有0.5mL生理鹽水的勻漿器中粉碎勻漿。將懸浮液倒入10mL試管內(nèi)(冰浴)，用0.3mL生理鹽水洗勻漿器并倒入懸浮液中，混勻靜置5min，離心(1 400×g, 15min)，收集上清液，按試劑盒說明書測定cAMP和PGE2的含量。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0軟件處理，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 廣藿香油對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔體溫的影響

實驗過程中，空白對照組家兔體溫在正常范圍內(nèi)波動，模型對照組造模后各時點體溫升高明顯，與空白對照組比較有顯著差異(P<0.01)。陽性組及給藥組造模后各時點體溫均升高，但升高度數(shù)均低于各時點模型對照組的體溫升高度數(shù)。西藥陽性組給藥后0.5 h有明顯的解熱作用，與模型對照組比較有顯著差異(P<0.05)，其余各時點與模型對照組比較無顯著差異。中藥陽性組給藥后1 h和2.5 h無明顯的解熱作用，其余各時點均有明顯的解熱作用，與模型對照組比較有顯著差異(P<0.05)。廣藿香油高劑量組從給藥后1.5 h開始有明顯的解熱作用，一直持續(xù)到給藥后5.5 h，與模型對照組比較有顯著差異(P<0.05)。廣藿香油中劑量組給藥后3.5 h開始有明顯的解熱作用，一直持續(xù)到給藥后5.5 h，與模型對照組比較有顯著差異(P<0.05)。這表明廣藿香油對內(nèi)毒素所致發(fā)熱模型家兔有顯著解熱作用，見表1。

表1 廣藿香油對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔體溫的影響

LAI: lysine acetylsalicylate for injection; SI: shuanghuanglian injection.△△P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

2 廣藿香油對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔血清中IL-1β和TNF-α含量的影響

模型對照組家兔血清中IL-1β和TNF-α含量均明顯高于空白對照組，與空白對照組比較均有顯著差異(P<0.05)。西藥陽性組和中藥陽性組家兔血清中IL-1β和TNF-α含量均明顯低于模型對照組(P<0.01或P<0.05)。廣藿香油各劑量組家兔血清中IL-1β含量與模型對照組比較無顯著差異，但均有降低IL-1β含量的趨勢。廣藿香油中劑量組家兔血清中TNF-α含量明顯低于模型對照組(P<0.05)。這表明廣藿香油可明顯抑制內(nèi)毒素致發(fā)熱家兔血清中TNF-α含量的產(chǎn)生，見表2。

表2廣藿香油對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔血清中IL-1β和TNF-α對含量的影響

Table 2. The effect of IL-1β and TNF-α contents in the serum of rabbits with LPS-induced fever(Mean±SD.n=6)

GroupIL-1β(pg/L)TNF-α(ng/L)Control422.64±146.44130.93±8.88Model831.83±31.39△152.24±10.71△LAI442.56±27.70??126.40±7.17?SI365.88±66.12??130.80±12.93?High 738.38±145.60144.84±16.10Middle807.74±78.25132.98±18.32?Low808.01±69.76144.62±16.66

△P<0.05vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

3 廣藿香油對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔下丘腦中cAMP和PGE2含量的影響

模型對照組家兔下丘腦中cAMP和PGE2含量均明顯高于空白對照組，與空白對照組比較均有顯著差異(P<0.05)。西藥陽性組和中藥陽性組家兔下丘腦中cAMP含量均明顯低于模型對照組，與之比較均有顯著差異(P<0.05)。西藥陽性組和中藥陽性組家兔下丘腦中PGE2含量與模型對照組比較均無顯著差異。廣藿香油各劑量組家兔下丘腦中cAMP含量明顯低于模型對照組，與之比較有顯著差異(P<0.05)。廣藿香油各劑量組家兔PGE2含量與模型對照組比較均無顯著差異，但均有降低PGE2含量的趨勢。這表明廣藿香油可明顯抑制內(nèi)毒素致發(fā)熱家兔下丘腦中cAMP含量的產(chǎn)生，見表3。

表3廣藿香油對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔下丘腦中cAMP和PGE2含量的影響

Table 3. The cAMP and PGE2contents in the hypothalamus of rabbits with LPS-induced fever (Mean±SD.n=6)

GroupcAMP (nmol/L)PGE2 (ng/L)Control18.48±1.9683.82±15.28Model21.65±1.36△114.66±10.12△LAI17.96±1.42?93.11±15.53SI17.13±1.53?97.02±4.79High17.30±0.77?98.10±12.47Middle18.66±4.34?110.51±31.88Low17.49±1.10?87.64±18.90

△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

討 論

內(nèi)毒素是外源性致熱原，通過激活體內(nèi)的單核巨噬細胞產(chǎn)生并釋放內(nèi)生致熱原引起發(fā)熱反應[5]。本實驗觀察到家兔耳緣靜脈注射內(nèi)毒素后，體溫明顯升高，而廣藿香油有明顯的解熱作用，可明顯抑制內(nèi)毒素導致的體溫升高。與西藥賴氨匹林和中藥雙黃連注射液比較，西藥賴氨匹林主要特點是降體溫快，但持續(xù)時間短；中藥雙黃連注射液主要特點是間歇性降體溫，但作用不穩(wěn)定；而廣藿香油降體溫的作用效果穩(wěn)定、持久、無反復。

內(nèi)生致熱原是多種致熱性細胞因子，包括IL-1、IL-6、干擾素、TNF、巨噬細胞炎癥蛋白-1等[6]。IL-1是重要的致熱性細胞因子，因基因編碼不同分為IL-1α和IL-1β，實驗證實IL-1β具有明顯的致熱性，是參與多種致熱原性發(fā)熱的重要細胞因子[7]。TNF主要以2種蛋白質(zhì)形式存在，即：TNF-α和TNF-β，而TNF-α被認為是其發(fā)熱的主要調(diào)節(jié)因子[8]，大量資料表明，內(nèi)毒素性發(fā)熱時血漿和腦脊液中TNF-α含量均明顯升高[9]。內(nèi)生致熱原可直接或間接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱中樞介質(zhì)cAMP、PGE2、促皮質(zhì)激素釋放激素等的釋放，繼而引起發(fā)熱。cAMP為腦內(nèi)多種介質(zhì)的第二信使，許多學者主張cAMP是主要的中樞發(fā)熱介質(zhì)[10]。在多種動物發(fā)熱模型的研究中均發(fā)現(xiàn)，下丘腦中cAMP含量與體溫變化呈正相關(guān)[11]。內(nèi)毒素性發(fā)熱呈多相性，PGE2在其所有階段皆有調(diào)節(jié)作用，是重要的中樞調(diào)節(jié)介質(zhì)[12]。內(nèi)毒素性發(fā)熱時，下丘腦中PGE2含量明顯升高[13]。

本實驗觀察到靜脈注射內(nèi)毒素后3 h，模型對照組血清中IL-1β和TNF-α以及下丘腦中cAMP和PGE2含量均明顯升高。廣藿香油可明顯抑制血清中TNF-α和下丘腦中cAMP含量的升高，廣藿香油中劑量組血清中TNF-α含量明顯低于模型對照組，廣藿香油各劑量組下丘腦中cAMP含量均明顯低于模型對照組；有降低血清中IL-1β和下丘腦中PGE2含量升高的趨勢。

綜上所述，廣藿香油對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔有解熱作用，其解熱機制可能與抑制內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔血清中TNF-α和下丘腦中cAMP含量升高有關(guān)。

[參 考 文 獻]

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典一部[M]. 2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：373.

[2] 楊甫傳，徐麗珍，鄒忠梅，等. 廣藿香醇及廣藿香油中廣藿香醇在大鼠體內(nèi)藥代動力學比較[J]. 藥學學報，2004, 39(9):726-729.

[3] 肖翔林，龍膺西. 近年來廣藿香的研究概況[J]. 中藥材，2004, 27(6):456-458.

[4] 劉紅淼，李艷玲，楊繼章. 廣藿香油的藥理作用研究進展[J]. 中國藥房，2012, 23(47)：4506-4507.

[5] 趙紅艷，張 璠，李守拙，等. 野黃芩甙對發(fā)熱家兔下丘腦及腦脊液中環(huán)磷腺苷含量的影響[J]. 中國醫(yī)科大學學報，2003, 32(2):115-119.

[6] 蔣玉鳳，張丹卉，黃啟福，等. 清開靈對內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔的解熱機制研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學學報，2003, 26(5):53-55.

[7] Kozak W, Kluger MJ, Soszynski D,et al. IL-6 and IL-1 beta in fever： studies using cytokine-deficient (knockout) mice[J]. Ann N Y Acad Sci, 1998, 856:33-47.

[8] 徐志勇. 穿心蓮軟膠囊部分毒理、藥效學研究及解熱機制初探[D]. 廣州：廣州中醫(yī)藥大學臨床藥理研究所，2005：1-43.

[9] Kao TY, Huang WT, Chang CP, et al. Aspirin may exert its antipyresis by inhibiting the N-methyl-D-aspartate receptor-dependent hydroxyl radical pathways in the hypothalamus[J]. J Pharmacol Sci, 2007, 103(3):293-298.

[10] 馬仁強，吳先哲. 清金注射液解熱作用機制的探討[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2003, 14(6):330-331.

[11] 李 東，楊芳炬，黃繼華，等. 注射用清開靈凍干粉解熱鎮(zhèn)痛作用及解熱機制的試驗研究[J]. 中藥材, 2005, 28(9):796-799.

[12]YaoXJ,YinJA,XiaYF,etal.Puerarinexertsantipyreticeffectonlipopolysaccharide-inducedfeverinratsinvolvinginhibitionofpyrogenproductionfrommacrophages[J].JEthnopharmacol, 2012, 141(1):322-330.

[13] Tsai CC, Lin MT, Wang JJ, et al. The antipyretic effects of baicalin in lipopolysaccharide-evoked fever in rabbits[J]. Neuropharmacology, 2006, 51(4):709-717.