劉帆，邸亞麗，紀征，尚小明

論著·基礎(chǔ)

參芍口服液對缺血再灌注心肌大鼠MMP-2、TIMP-2 和心肌激酶的影響

劉帆，邸亞麗，紀征，尚小明

基金課題: 河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥類科研計劃(No.20013122)

目的觀察參芍口服液對心肌缺血再灌注損傷大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)和心肌激酶的影響。方法選取40只SD大鼠，隨機平均分為4組，即假手術(shù)組(A組)、缺血再灌注組(B組)、參芍口服液組(C組)、瑞舒伐他汀組(D組)，每組10只。C組、D組分別于術(shù)前3 d給予參芍口服液8 ml/d、瑞舒伐他汀10 mg/d灌胃，A組、B組給予生理鹽水。采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支30 min再灌注120 min的方法復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注模型(假手術(shù)組不結(jié)扎)。分析各組大鼠心肌HE染色情況、MMP-2和TIMP-2的表達、心肌激酶變化。結(jié)果心肌HE染色：A組心肌結(jié)構(gòu)正常，B組心肌細胞破壞最嚴重，C組心肌細胞破壞程度較B組和D組明顯減輕。免疫組化檢測：MMP-2蛋白的表達水平A組C組>D組>B組，各組間相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。大鼠心肌酶：CK的水平A組有很少量的表達，其余各組均有大量表達(P<0.05)；CK-MB、LDH的水平A組

參芍口服液；缺血再灌注；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2；大鼠

近年來，心肌缺血再灌注損傷已成為冠狀動脈內(nèi)溶栓、冠狀動脈搭橋以及介入治療中常見的嚴重并發(fā)癥。參芍口服液是唐山工人醫(yī)院制備的純中藥復(fù)方制劑，其主要成分有丹參、黃芪、當歸、赤芍、川芎等，具有活血化瘀、通絡(luò)的功效，已經(jīng)證實對冠心病、高血脂、心絞痛患者有一定的療效[1]。目前尚沒有關(guān)于參芍口服液對基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在心肌缺血再灌注方面的研究。本研究采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的缺血再灌注模型大鼠, 研究參芍口服液對大鼠心肌MMP-2和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)蛋白表達的影響, 探討其保護作用的可能分子生物學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物： 健康雄性SD大鼠，清潔型，共40只，體質(zhì)量(250±50) g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動物實驗中心提供, 合格證號:SCXK-(軍)-2009-003。

1.1.2 藥品及試劑： 參芍口服液(唐山工人醫(yī)院制藥室)，瑞舒伐他汀鈣(南京正大天晴制藥有限公司生產(chǎn))。MMP-2和TIMP-2兔抗鼠多克隆一抗工作液(美國Bioword技術(shù)公司生產(chǎn))，SP免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色液(福州萊博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))。

1.1.3 實驗儀器： 呼吸機(美國CWE公司生產(chǎn))，Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(澳大利亞ADInstruments公司生產(chǎn))。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作： 動物稱重，用10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射徹底麻醉后，左上肢和雙下肢經(jīng)皮插入針形心電圖電極, 連接Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，調(diào)試參數(shù)。經(jīng)口氣管插管連接呼吸機輔助呼吸(頻率90～100次/min，潮氣量8～10 ml/min)，沿胸骨左緣4～5肋間水平切開肋間肌肉組織，用開瞼器撐開肋骨暴露心臟，結(jié)扎冠狀動脈左前降支(假手術(shù)組不結(jié)扎)，此時心電示波可見ST段弓背向上抬高，30 min后放開縫線，可見ST段回落，幅度大于50%，120 min后從頸內(nèi)動脈取血后處死大鼠。

1.2.2 分組及給藥方法： 實驗動物隨機分為4組，即假手術(shù)組(A組)、缺血再灌注組(B組)、參芍口服液組(C組)、瑞舒伐他汀組(D組)，每組10只。C組、D組分別于術(shù)前3 d給予參芍口服液8 ml/d、瑞舒伐他汀10 mg/d(溶于8 ml生理鹽水中)灌胃，A組、B組給予等體積生理鹽水，本實驗參考陳奇主編的《中藥藥理實驗方法學(xué)》進行人與大鼠用藥劑量的換算。

1.3 檢測指標

1.3.1 HE染色： 心肌組織經(jīng)過4%的多聚甲醛固定(48 h以上)、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋制成蠟塊后切片，經(jīng)梯度酒精脫蠟至水后行蘇木素5 min、鹽酸酒精15 s、自來水沖洗至核呈藍色，95%乙醇2 min、伊紅1 min染色，后經(jīng)梯度酒精脫水透明后封片，觀察心肌組織變化。

1.3.2 免疫組化檢測MMP-2、TIMP-2： 石蠟切片后常規(guī)脫蠟至水;于沸騰的枸櫞酸緩沖液中進行抗原修復(fù)5 min后自然冷卻，PBS洗3次; 3%H2O2阻斷10 min，PBS洗3次; 滴加5%BSA封閉液，室溫孵育15 min，不洗；加一抗工作液4℃冰箱過夜18～24 h，PBS 洗3次;滴加二抗工作液，37℃烤箱中孵育15 min，PBS洗3次；滴加試劑SP，37℃烤箱中孵育15 min，PBS洗3次；DAB顯色液，室溫下避光孵育，當看到組織細胞著棕黃色后，立即放入蒸餾水中終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片。MMP-2、TIMP-2的蛋白陽性表達呈棕黃色均位于心肌細胞胞漿。光學(xué)顯微鏡下觀察6個高倍視野并采集圖像，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行圖像分析，計算指定區(qū)域的面積(area)以及該區(qū)域內(nèi)部特定染色部分的累積光密度(IOD)，從而計算出該區(qū)域內(nèi)特定染色物的平均光密度(mean density=IOD/area)。

1.3.3 心肌激酶： 自大鼠右側(cè)頸內(nèi)動脈抽血后離心，取上層血清，檢測每組大鼠血清中心肌酶CK、CK-MB、LDH的含量，化驗儀器為Beckman-couter All 5800 全自動生化分析儀，化驗試劑由該儀器同廠家提供。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0軟件統(tǒng)計分析處理。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌HE染色比較 A組：心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肌絲完整無斷裂；B組：心臟組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，心肌間質(zhì)水腫明顯，心肌細胞萎縮，纖維斷裂，心肌損傷嚴重；C組：心肌細胞形態(tài)、胞質(zhì)、間質(zhì)及橫紋較為正常，個別心肌細胞水腫，心肌損傷較輕；D組變化介于B、C組之間(圖1見封3)。

2.2 免疫組化檢測MMP-2、 TIMP-2比較 免疫組化檢測MMP-2：A組有很少量的表達，B組表達量最多，C組較B組明顯減少，D組介于B組和C組之間，且各組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2見封3)；免疫組化檢測TIMP-2:A組有大量的表達，B組有很少量的表達，C組較B組明顯增多，D組介于B組和C組之間，且各組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3見封3)。見表1。

表1 各組大鼠MMP-2和TIMP-2的OD值

注：與A組相比,aP<0.01;與B組相比,bP<0.0;與C組相比,cP<0.05

2.3 心肌激酶比較 心肌細胞磷酸肌酸激酶(CK)除A組有很少量表達外，其余各組均較高且組間無明顯差異，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及乳酸脫氫酶(LDH)釋放量A組有很少量表達，B組表達最多，C組較B組有明顯減少，D組介于B組和C組之間且各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌酶的變化

注：與A組相比,aP<0.01;與B組相比,bP<0.01;與C組相比,cP<0.01

3 討 論

目前，我國急性心肌梗死(AMI)的介入治療已極為廣泛，經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)治療前均會使用一定劑量的抗凝抗血小板和降脂穩(wěn)定斑塊的藥物，盡管可造成不同類型不良反應(yīng)，尤其存在1%～2%致命性出血和一過性肝損傷等并發(fā)癥，但這些藥物的應(yīng)用已被肯定，成為介入治療前后的必用藥物[2]。參芍口服液是尚小明[3]及多名心內(nèi)科專家根據(jù)多年臨床經(jīng)驗獨創(chuàng)的處方,具有活血化瘀，益氣通絡(luò)的功效，對于氣虛血瘀，脈絡(luò)閉阻所致的胸痹、心痛證十分有效。前期實驗中發(fā)現(xiàn)，參芍口服液可通過上調(diào)脂聯(lián)素水平，下調(diào)瘦素水平，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[4]；亦可通過調(diào)脂、抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等多條途徑發(fā)揮抗主動脈粥樣硬化的作用[5]；在大鼠心肌梗死模型中，參芍口服液能降低急性心肌梗死急性期血清 MDA 含量，提高T-SOD 活性，具有清除氧自由基作用，從而發(fā)揮心肌保護作用[6]。目前對于急性缺血再灌注方面的研究較少。

研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotei-nases，MMPs)參與血小板聚集、心肌缺血再灌注損傷等急性過程。在多種心血管疾病如動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭、心室重構(gòu)[7]、動脈損傷后新生內(nèi)膜形成中發(fā)揮重要作用。適當抑制MMPs有望成為治療心血管疾病的藥物靶點[8]。MMP-2 和 TIMP-2 作為心肌組織中內(nèi)源性的細胞因子，參與到細胞外基質(zhì)降解、介導(dǎo)炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管功能、影響細胞凋亡與存活等眾多病理生理過程，這些過程均在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用[9～11]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：C組MMP-2蛋白的表達明顯低于B組，TIMP-2表達明顯高于B組，心肌組織的破壞較B組明顯減輕，心肌酶CK-MB、LDH水平明顯低于B組，而D組的表達介于B、C組之間；說明參芍口服液是通過降低MMP-2、升高TIMP-2的表達從而實現(xiàn)對心臟缺血再灌注損傷的保護作用。

綜上所述，參芍口服液由丹參、黃芪、當歸、川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍、水蛭、清半夏等珍貴藥材配制而成，每味草藥均有自己的獨特功效[12～16]。本方重用丹參為君藥，活血止痛，養(yǎng)血安神；黃芪甘，微溫，有益氣固表、利水消腫之功效；當歸補血活血，兩藥配合君藥，有活中兼養(yǎng)、祛瘀不傷血之妙，是為臣；川芎、赤芍、桃仁、紅花活血通絡(luò)；地龍、水蛭蟲類藥，長于行散走竄，通經(jīng)活絡(luò)；清半夏燥濕化痰，降逆止嘔；以上均為佐藥。幾味藥合用，活血化瘀，益氣通絡(luò)，能增加外周血流量，抑制炎性反應(yīng)、保護血管內(nèi)皮，抗血栓等作用，對于臨床上常見的胸悶刺痛，心悸氣短，倦怠乏力等冠心病、心絞痛癥狀有特效，對介入治療心肌梗死的患者術(shù)后出現(xiàn)的再灌注損傷有保護作用，且較證據(jù)確鑿的他汀類藥物作用更明顯。

1 薛忠文，董天崴，張琦，等.參芍口服液對冠狀動脈粥樣硬化大鼠主動脈IL-8 VCAM-1和ICAM-1表達的影響[J].中成藥雜志，2014,34(11)：2077-2081.

2 尤士杰，楊躍進，陳可冀，等.通心絡(luò)膠囊在急性心肌梗死血運重建后的有效性和安全性研究[J].疑難病雜志，2004，3(4)：193-196.

3 尚小明. 治療心絞痛、心肌梗死及預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的中藥制劑[P].中國專利:200810101324,2008-03-04.

4 王晨. 參芍口服液對大鼠動脈粥樣硬化的防治研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2011.

5 薛忠文. 參芍口服液對大鼠主動脈粥樣硬化的療效及其機制[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

6 李霞. 曲美他嗪與寬心合劑對急性心肌梗死大鼠心肌保護作用的研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2007.

7 李霞，賀博然，許丹，等.寬心合劑對大鼠心臟急性缺血—再灌注損傷后心室重構(gòu)的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2010，13(4C)：1304-1306.

8 賀曉楠，李淑梅.基質(zhì)金屬蛋白酶在心肌缺血再灌注損傷中的研究進展[J].中國老年病雜志，2009,11(29)：2979-2981.

9 劉海龍，吳黎明，許圓圓.在體大鼠心肌缺血再灌注中MMP-2/9、TIMP-1/2mRNA和蛋白表達及MMP-2/9酶活性的同步動態(tài)變化[J]. 中國分子心臟病學(xué)雜志，2009,9(6):332-337.

10 Halapas A，Zacharoulis A，Theocharis S，et a1．Serum levels of the osteoprotegerin，receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,Metalloproteinase-1(MMP-I)and tissue inhibitors of MMP-I levels are increased in men 6 months after acute myocardial infarction[J]．Clin Lab Med，2008，46(4)：510-6．

11 Beefi R，Yogefy C,Guerrero JL，et al.Mitral regurgitation augments postmyocardial infarction remodeling failure of hypertrophic[J]．J Am Coll Cardiol，2008，51(4)：476-86.

12 張卓然,李鴻珠,高君,等.丹參注射液抑制大鼠心肌缺血—再灌注損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2009,37(4):14-17.

13 陳衛(wèi)鋒,王鹿,王蕊.維藥愛維心口服液對大鼠缺血再灌損傷心肌細胞凋亡的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2009,24(11):1521-1523.

14 陳義斌. 川芎嗪對缺血再灌注所致大鼠離體心臟損傷的保護作用[J].醫(yī)學(xué)信息,2006,19(5):826.

15 朱艷霞,張端蓮.當歸注射液對缺血再灌注損傷心肌細胞組織化學(xué)變化的影響[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2007,20(1):53.

16 周蘇寧, 邵偉, 張文高，等. 黃芪注射液抗心肌缺血再灌注損傷的臨床研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2000,7(3):168.

EffectsofShenshaooralliquidonMMP-2,TIMP-2expressionandmyocardialenzymeofmyocardiumischemiareperfusioninrats

LIUFan*,DIYali,JIZheng,SHANGXiaoming.

*HebeiUnitedUniversityGraduateAcademy,HebeiProvince,Tangshan063000,China

SHANGXiaoming,E-mail:Shxm@vip.163.com

ObjectiveTo observe the effect ofShenshaooral liquid on myocardial ischemia reperfusion injury, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 (TIMP-2)and myocardial kinase of rat model.Methods40 SD rats were randomly divided into 4 groups, namely sham operation group (A group), ischemia reperfusion group (B group) andShenshaooral liquid group (C group) and rosuvastatin group (D group), 10 rats in each group. C group and D group were given 3 days ofShenshaooral liquid for 8 ml/d, rosuvastatin 10 mg/d orally before operation, A group, B group

saline. By using the method of the left coronary artery ligation on rats anterior descending artery for 30 min, then reperfusion for 120 min to replicate myocardial ischemia reperfusion rats model (sham operation without ligation). Analyze rat myocardial HE staining, MMP-2 and TIMP-2 expression and myocardial kinase changes.ResultsMyocardial HE staining: A group myocardial structure was normal, the most serious damage to myocardial cells was in B group, C group’s myocardial cell damage was milder than that in group B and D group. Immunohistochemical detection: MMP-2 protein expression level was A group C group >D group >B group, there was statistical significance among each group (P<0.05). Rat myocardial enzyme: level of CK expression was very small in A group, the other groups were expressed a lot (P<0.05); CK-MB, LDH level: A group

Shenshaooral liquid; Ischemia reperfusion; Matrix metalloproteinase 2; Tissue inhibitor of metalloproteinase 2;Rets

063000 河北唐山，河北聯(lián)合大學(xué)研究生院(劉帆)； 唐山工人醫(yī)院心內(nèi)一科(邸亞麗、紀征、尚小明)

尚小明，E-mail:Shxm@vip.163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.09.016

2014-06-08)