程琳，夏豪

論著·基礎

心肌梗死后小鼠心肌Bax和Bcl-2的表達

程琳，夏豪

目的研究心肌梗死后小鼠心臟中Bax和Bcl-2的表達。方法雄性C57BL/6小鼠40只隨機分為2組：對照組(10只)和實驗組(30只)，實驗組結扎冠狀動脈左前降支建立心肌梗死模型，對照組僅在冠狀動脈前降支處穿過縫線，不做結扎。術后4周對2組小鼠進行心肌取材，Western blot方法檢測Bax和Bcl-2蛋白在心臟表達的差異。結果實驗組小鼠術后4周存活率為53.3%(16/30)，對照組為100%(10/10)。Bax和Bcl-2在對照組心肌均有表達，在實驗組小鼠心臟遠離梗死區(qū)(N)、心肌梗死周邊區(qū)(B)、梗死區(qū)(I)的表達逐漸增加(P<0.05)，且B區(qū)、I區(qū)Bax/Bcl-2比值高于N區(qū)及對照組(P<0.05)。結論Bax和Bcl-2在心肌梗死后心臟中呈高表達，且Bax/Bcl-2比值在心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)顯著增加，提示凋亡可能在心肌梗死后心臟重構中發(fā)揮重要作用。

心肌梗死;凋亡;Bax;Bcl-2；小鼠

心肌梗死后心臟重構包括心肌細胞凋亡、肥大、壞死及心肌基質膠原纖維合成和降解的動態(tài)平衡。近年來凋亡在心肌梗死后心臟重構中的作用受到廣泛關注[1，2]，Bax和Bcl-2是凋亡的重要調控因子，二者如何調控心肌細胞凋亡的發(fā)生以及凋亡發(fā)生的機制仍有待進一步研究?，F(xiàn)建立小鼠心肌梗死模型并檢測Bax和Bcl-2在心肌梗死后心臟各區(qū)域的表達差異，探討其在心肌梗死后心臟重構中的重要作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為C57BL/6遺傳背景的野生型雄性小鼠(C57)40只，SPF級，體質量23～28 g，8～9周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。隨機分為對照組10只，實驗組30只，一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司，包括Bax(2772)、Bcl-2(2870)、GAPDH (2118)；二抗包括Goat anti-Rabbit IRD 800CW(92632211，Li-Cor)和Goat anti-Mouse IRD 800CW(92632210，Li-Cor)。其他實驗材料包括BCA蛋白定量試劑盒(23225，Thermo), PVDF膜(ISEQ00010，Millipore)、預染彩色蛋白質低分子量Marker(SM0671，F(xiàn)ermentas)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備心肌梗死模型： 參考國內動物模型制備相關文獻建立小鼠心肌梗死模型[3～5]。實驗組小鼠采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，左側胸部手術區(qū)備皮后消毒，加熱墊上插管并連接小動物呼吸機，沿3～4肋間水平切開皮膚，逐層分離肌肉及軟組織，暴露心臟，在肺動脈圓錐與左心耳之間距離主動脈根部1 mm處結扎前降支。此時觀察到縫線下方區(qū)域變白、局部心肌運動減弱后逐層縫合胸壁。對照組僅穿縫線不結扎，其余處理方法同實驗組。待小鼠恢復自主呼吸后拔除通氣導管，置于加熱墊上繼續(xù)觀察，動物清醒后更換新飼養(yǎng)籠，添加飼料和飲水后送回飼養(yǎng)室。

1.2.2 取材： 術后小鼠自由進食和飲水，每天觀察并記錄小鼠狀態(tài)及存活情況。如發(fā)現(xiàn)動物死亡，查明原因。術后4周心臟標本取材，需迅速將其置于10%KCl溶液中，輕柔擠去心腔內殘余血液，待心臟停跳于舒張期后迅速切除心房及右心室，對照組左心室縱向對稱取材分為2部分，實驗組左心室根據(jù)梗死范圍分為3部分取材：遠離梗死區(qū)(N)、周邊區(qū)(B)及心肌梗死區(qū)(I)，取材后迅速置于液氮中暫時保存后轉移至-80℃冰箱保存。

1.3 檢測指標 小鼠心臟組織中Bax 和Bcl-2蛋白的表達：-80℃冰箱取出小鼠心臟組織，裂解液提取組織蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，濃度經(jīng)校正后取等量蛋白用自制10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，處理后與相應一抗4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后室溫避光孵育二抗1 h，熒光顯色后以Quality One軟件 (version 4.6.2,Bio-Rad)半定量分析熒光強度。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 存活率 實驗組小鼠術后4周存活率為53.3%(16/30)，小鼠死亡主要集中在術后第1周，一旦死亡立即進行解剖，可見小鼠胸腔大量血塊及心肌梗死區(qū)心尖部破裂口。對照組小鼠術后4周存活率100%(10/10)。

2.2 Bax和Bcl-2蛋白表達 Western blot(免疫印跡法)分析對照組和實驗組手術后4周Bax和Bcl-2蛋白的表達，以GAPDH為內參，結果見圖1；結果分析顯示：Bax、Bcl-2在對照組均有表達，在實驗組小鼠心臟N區(qū)、B區(qū)及I區(qū)表達均逐漸增加(P<0.05)；I區(qū)、B區(qū)Bax/Bcl-2比值顯著高于N區(qū)和對照組小鼠心臟(P<0.05)，見圖2。

圖1 2組小鼠術后4周心臟中Bax和Bcl-2的表達

注：與對照組比較，aP<0.05；與N區(qū)比較，bP<0.05；與B區(qū)比較，cP<0.05

圖2 2組小鼠術后4周心臟不同區(qū)域Bax和Bcl-2的表達

3 討 論

心肌梗死是臨床常見的威脅人類健康和生命的疾病，急性心肌梗死后左室重構介導的心力衰竭和惡性心律失常更是導致惡性心臟事件發(fā)生和死亡的主要原因。隨著顯微外科技術的發(fā)展和人們對小鼠模型優(yōu)越性的認識，如易于飼養(yǎng)、繁殖力強、周期短及其調節(jié)心臟血管發(fā)育的基因、信號通路與人類相似性強等，越來越多的國內外研究采用小鼠進行心肌梗死方面的實驗研究，通過建立小鼠心臟疾病動物模型可幫助闡明該疾病的機制[6～8]。

目前常用的心肌梗死造模方法主要有冠狀動脈前降支結扎法和大劑量異丙基腎上腺素誘發(fā)等方法[9，10]，冠狀動脈結扎法通過閉塞冠狀動脈引起心肌梗死，可以最大限度模擬臨床心肌梗死過程。固定的結扎部位是穩(wěn)定的心肌梗死模型的前提，實驗組術中2只小鼠結扎后縫線下方區(qū)域未見變白，可能與冠狀動脈的生理變異等原因有關。小鼠心肌梗死后4周存活率為53.3%，心臟破裂是主要的早期并發(fā)癥和致死原因。心尖部心室壁較薄，供血終端區(qū)的壞死程度顯著，側支循環(huán)少，心肌收縮對無活動力并僵硬的壞死區(qū)產(chǎn)生的剪力效應等都是引起心臟破裂的局部因素[11]。

長期以來人們認為凝固性壞死是心肌細胞的主要死亡方式，近期許多研究表明更多的心肌細胞是死于凋亡，部分心肌細胞由于能量缺乏可從凋亡轉向壞死。凋亡是心肌梗死面積大小的主要決定因素，心肌細胞凋亡的持續(xù)存在擴大了梗死面積，使心肌進行性丟失，梗死范圍延展，室壁變薄，心室擴張，心臟重構逐漸發(fā)生發(fā)展為心力衰竭。心肌梗死后心肌各區(qū)域凋亡的不同表現(xiàn)成為目前研究的熱點[12，13]，梗死周邊區(qū)心肌細胞的凋亡可能與梗死范圍的延展有關。

細胞凋亡是機體細胞在生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程，它的發(fā)生受到機體的嚴密調控。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡的重要調控因子，它定位于細胞內膜系統(tǒng)，主要存在于線粒體外膜、核膜和內質網(wǎng)，是一種原癌基因。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促進凋亡蛋白，二者單獨具有調控細胞凋亡的功能，還可以形成同源二聚體及異源二聚體，二者相互拮抗共同調節(jié)著細胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)Bax、Bcl-2在對照組小鼠和實驗組小鼠心臟遠離梗死區(qū)、周邊區(qū)及心肌梗死區(qū)表達逐漸增加；Bax/Bcl-2比值在實驗組心臟周邊區(qū)及心肌梗死區(qū)表達顯著高于對照組心臟和實驗組心臟遠離梗死區(qū)。證實了Bax 和Bcl-2 在心肌梗死后心臟中呈高表達，且Bax/Bcl-2比值在心肌梗死周邊區(qū)顯著增加，提示凋亡在晚期心肌梗死后心臟重構中發(fā)揮重要作用。

1 Liu ZH,Yang D,Xie P,et al. MiR-106b and MiR-15b modulate apoptosis and angiogenesis in myocardial infarction[J]. Cell Physiol Biochem, 2012, 29(5/6): 851-862.

2 Nef HM,M?llmann H, Hilpert P, et al. Activated cell survival cascade protects cardiomyocytes from cell death in Tako-Tsubo cardiomyopathy[J]. Eur J Heart Fail, 2009, 11(8): 758-764.

3 尉新華，范慧敏，李鐵巖，等．小鼠心肌梗死模型的建立和無創(chuàng)評價方法[J]．同濟大學學報:醫(yī)學版，2011，32(5)：20-22, 35．

4 張浩，侯邁，胡盛壽．小鼠心肌梗死模型的建立和無創(chuàng)超聲評價[J]．中國微創(chuàng)外科雜志，2007，7(11)：1111-1112．

5 趙曉輝，周健，馬瑞彥，等．建立小鼠心肌梗死模型的研究[J]．四川動物，2006，25(3)：627-629, 封4．

6 Li HL,Tang QZ,Liu C,et al. Cellular FLICE-inhibitory protein protects against cardiac remodeling induced by angiotensin II in mice[J]. Hypertension, 2010, 56(6): 1109-1117.

7 Mostarda C, Rodrigues B, Vane M, et al. Autonomic impairment after myocardial infarction: role in cardiac remodelling and mortality[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010, 37(4): 447-452.

8 Xiao JF,Moon M, Yan L,et al.Cellular FLICE-inhibitory protein protects against cardiac remodelling after myocardial infarction[J]. Basic Res Cardiol, 2012, 107(1): 239.

9 Korkmaz S, Radovits T, Barnucz E, et al. Pharmacological activation of soluble guanylate cyclase protects the heart against ischemic injury[J]. Circulation, 2009, 120(8): 677-686.

10 Liu B,Li WM,Li Y,et al. Protective effects of N-acetylcysteine in isoproterenol-induced myocardium injury in rats[J]. Mol Biol Rep, 2009, 36(4): 761-765.

11 Birnbaum Y, Chamoun AJ,Anzuini A, et al. Ventricular free wall rupture following acute myocardial infarction[J]. Coron Artery Dis, 2003, 14(6): 463-470.

12 Arakawa M, Yasutake M, Miyamoto M, et al. Transduction of anti-cell death protein FNK protects isolated rat hearts from myocardial infarction induced by ischemia/reperfusion[J]. Life Sci, 2007, 80(22): 2076-2084.

13 Lazou A,Iliodromitis EK,Cieslak D,et al.Ischemic but not mechanical preconditioning attenuates ischemia/reperfusion induced myocardial apo-ptosis in anaesthetized rabbits:the role of Bcl-2 family proteins and ERK1/2[J]. Apoptosis, 2006, 11(12): 2195-2204.

ExpressionofBaxandBcl-2inmicewithmyocardialinfarction

CHENGLin,XIAHao.

DepartmentofCardiology,WuhanUniversityAffiliatedTianyouHospital,Wuhan, 431000,China

XIAHao,E-mail:xiahao1966@163.com

ObjectiveTo determine the expression of apoptotic protein Bax and Bcl-2 in heart of mice after myocardial infarction.MethodsForty male C57BL/6 mice were randomly divided into 2 groups: the control group (10 rats) and experimental group (30 rats), in the experimental group, left anterior descending coronary artery was ligated to establish the model of myocardial infarction, in the control group, no ligation were performed in the anterior descending coronary artery. After 4 weeks, the 2 groups of mice's myocardial material were taken, western blot method were used for detection of Bax and Bcl-2 protein expression differences in the heart.Results4 weeks after operation, the survival rate of mice in the experimental group was 53.3% (16/30), the control group was 100% (10/10). Bax and Bcl-2 in the control group had the expression,in the experimental group,expression increased gradually in area far from myocardial infarcted (N),the surrounding area of myocardial infarction (B), infarction area (I) (P<0.05), and the B zone, I zone Bax/Bcl-2 ratio is higher than that of N and control group (P<0.05).ConclusionThe high expression of Bax and Bcl-2 in heart after myocardial infarction may suggest that apoptosis plays an important role in later period of cardiac reconstruction after myocardial infarction.

Myocardial infarction; Apoptosis; Bax; Bcl-2;Mice

國家自然科學基金面上項目(No.81270184)

430060 武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院心血管內科(程琳)； 武漢大學人民醫(yī)院心血管內科(夏豪)

夏豪，E-mail:xiahao1966@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.09.017

2013-02-28)