孟燕妮，陳艷萍，李秀龍，黃建寶

論著·臨床

結核感染T細胞斑點試驗聯(lián)合纖維支氣管鏡檢 在結核病患兒診斷中的應用

孟燕妮，陳艷萍，李秀龍，黃建寶

目的評價結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)聯(lián)合纖維支氣管鏡檢在肺結核患兒診斷中的價值。方法2010年3月—2012年12月住院疑診肺結核的患兒67例，均行PPD試驗、紅細胞沉降率、胸部CT、T-SPOT.TB、支氣管鏡檢(包括灌洗液作結核桿菌培養(yǎng)、熒光定量PCR和病理活檢)檢查。結果經(jīng)檢查臨床確診肺結核49例，慢性或遷延性肺炎9例，咳嗽變異性哮喘7例，支氣管異物1例，淋巴瘤1例。纖維支氣管鏡檢查炎性浸潤型18例(36.7%)，干酪壞死型5例(10.2%)，肉芽增殖型11例(22.5%)，瘢痕狹窄型15例(30.6%)。單項檢測結核菌培養(yǎng)和病理活檢與臨床診斷相比較，一致性差(Kappa值分別為0.09和0.29)，T-SPOT.TB和FQ-PCR單項檢測與臨床診斷結果相比，一致性一般(Kappa值分別為0.54和0.46)。聯(lián)合檢測：纖維支氣管鏡檢測(FQ-PCR+結核菌培養(yǎng)+病理活檢)與臨床診斷結果相比，一致性一般(Kappa值為0.55)；T-SPOT.TB聯(lián)合FQ-PCR檢測，一致性較好(Kappa值為0.64)，T-SPOT.TB與纖支鏡聯(lián)合檢測，一致性極高(Kappa值為0.85)。結論T-SPOT.TB聯(lián)合纖維支氣管鏡為診斷肺結核的有效手段。

肺結核；結核感染T細胞斑點試驗；纖維支氣管鏡

我國是結核病的高發(fā)國家之一，2010年全國結核病流行病學調查顯示新發(fā)病患者數(shù)為130萬例，僅次于印度[1],由于兒童各系統(tǒng)發(fā)育不完善，臨床表現(xiàn)不典型，加上目前傳統(tǒng)的結核檢測方法如PPD試驗、結核抗體、結核培養(yǎng)及涂片抗酸染色敏感性較低、特異性較差、操作復雜、檢測周期長等問題，導致兒童結核病診斷困難，臨床易誤診及漏診，因此積極尋求靈敏可靠的診斷方法具重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年3月—2013年12月在我科住院疑診結核的患兒67例，男40例，女27例，年齡2月～14歲，平均年齡(6.5±4.1)歲。臨床表現(xiàn)為咳嗽(62例)、喘息(38例)、發(fā)熱(23例)、咯血(3例)、體質量不增或消瘦(5例)，有明確結核接觸史8例?；純壕?jīng)過正規(guī)抗生素和對癥治療2周以上，癥狀遷延不愈，為明確診斷所有患兒均行PPD試驗、ESR、胸部CT、結核感染T細胞斑點試驗(tuberculosis infection of T cell spot test,T-SPOT.TB)、支氣管鏡檢(包括灌洗液結核桿菌培養(yǎng)、熒光定量PCR和病理活檢)。67例行支氣管鏡檢患兒均無嚴重的心肺功能受損、凝血功能正常、咯血患兒停止咯血7 d以上，告知家長纖維支氣管鏡的風險，家長理解并簽署知情同意書。

1.2 纖支鏡取材及標本處理 采用Olympus BF3C40和BFXP60兩種規(guī)格纖維支氣管鏡檢，術前6 h 禁食禁飲, 術前30 min肌注阿托品0.01 mg/kg，靜脈滴注咪達唑侖0.15 mg/kg。用1%利多卡因在鼻腔和咽喉部噴霧作局部表面麻醉。纖維支氣管鏡進入聲門后, 氣管內滴入1%利多卡因0.5 ～1.0 ml局部麻醉, 同時給予鼻導管吸氧,心電圖、呼吸和經(jīng)皮血氧飽和度監(jiān)測。參照X線胸片和/或CT片確定病變部位，纖支鏡下觀察病變部位，如發(fā)現(xiàn)病灶，則先用活檢鉗于病變部位取組織3～5塊，用10%福爾馬林液固定后送病理檢查。再用生理鹽水1 m1/kg分3次作支氣管灌洗，收集灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)作結核桿菌培養(yǎng)、熒光定量PCR。如鏡下未見明顯病灶，則參照影像學所示的病灶位置，按上述方法做沖洗；無明顯影像學改變者，則選擇有滲血或分泌物多的部位取組織標本和支氣管沖洗，所有標本及時送檢。

1.3 T-SPOT.TB 嚴格按照T-SPOT．TB 試劑盒(英國Oxford Immunotec Ltd 生產(chǎn))說明書操作。肝素抗凝管采集外周靜脈血5 ml，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。在已包被抗體的微量板的4個孔中，分別加入陽性對照植物血凝素，陰性對照細胞培養(yǎng)液，A 抗原早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)以及B 抗原濾液培養(yǎng)蛋白10(CFP-10)。然后每孔加入外周血單個核細胞，一起置于37℃ CO2培養(yǎng)箱(三洋MCO-175)溫孵16～20 h。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS) 洗脫，再加入堿性磷酸酶標記的抗干擾素抗體孵育2 h，PBS洗脫，顯色，PBS 終止。采用放大鏡人工計數(shù)斑點數(shù)。陽性結果定義為：測量孔點數(shù)是陰性對照的2 倍以上或者比陰性對照多5 個點。

1.4 熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR) 采用FQ-PCR方法測定BALF TB DNA。試劑盒為深圳市匹基生物工程股份有限公司產(chǎn)品，由PE5700全自動熒光定量PCR儀及計算機專用軟件自動分析，讀取TB DNA拷貝數(shù)?？截悢?shù)>103/ml判斷為陽性。

1.5 診斷方法 依據(jù)2006年中華醫(yī)學會兒科分會呼吸學組制定的“兒童肺結核的臨床診斷標準和治療方案”[1]診斷肺結核。(1)肺結核，包括肯定肺結核：結核桿菌培養(yǎng)陽性(金標準)；很可能肺結核：結核桿菌培養(yǎng)陰性，但臨床表現(xiàn)、影像學或病理學檢查支持結核，且抗結核治療有效；(2)非肺結核，臨床表現(xiàn)明確系其他疾病所致，或者經(jīng)其他治療(未經(jīng)抗結核治療)病情改善。綜合影像學、纖支鏡下表現(xiàn)、病原學、組織病理及對診斷性抗結核治療的反應來除外肺結核。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。以肺結核臨床確診為判斷標準，分別計算各種方法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及Youden指數(shù)，并分析與肺結核臨床診斷的一致性，用Kappa檢驗，Kappa值<0.4表明一致性差，Kappa值在0.4～0.6表明一致性一般，Kappa值在0.6～0.8表明一致性較好，Kappa值>0.8表明一致性極好。

2 結 果

67例經(jīng)檢查臨床診斷肺結核49例，男31例，女18例；排除結核18例，其中慢性或遷延性肺炎9例，咳嗽變異性哮喘7例，支氣管異物1例,淋巴瘤1例。

2.1 纖維支氣管鏡下表現(xiàn)

2.1.1 病變部位： 確診為肺結核的49例患者中，炎性浸潤型彌漫性病變18例；單部位受累17例，其中隆突1例，總氣管受累2例，左上葉段支氣管2例，左下葉段支氣管4例，右上葉段支氣管3例，右中葉段支氣管2例，右下葉段支氣管3例；多部位受累14例，其中同時累及左右支氣管5例，累及總氣管和右主支氣管2例，累及左上葉、左下葉段支氣管2例，累及右上葉、中葉段支氣管3例，右中葉、下葉段支氣管2例。

2.1.2 鏡下表現(xiàn)： (1)炎性浸潤型18例(36.7%)，表現(xiàn)為黏膜充血，水腫，糜爛易出血，可導致管腔狹窄，未見干酪樣物和瘢痕收縮。(2)干酪壞死型5例(10.2%)，支氣管黏膜充血水腫，表面覆蓋白色、黃白色苔樣壞死物。(3)肉芽增殖型(增殖型)11例(22.5%)，支氣管腔內可見增生的肉芽組織，呈菜花樣或結節(jié)狀向腔內突起，不同程度阻塞管腔。(4)瘢痕狹窄型(瘢痕型)15例(30.6%),黏膜突起，表面較為光滑，瘢痕組織交織，管腔扭曲變形，狹窄較為明顯。

2.2 各種方法對診斷肺結核的效能分析 T-SPOT.TB、FQ-PCR、結核菌培養(yǎng)、病理活檢分別對肺結核的效能分析見表1。49例肺結核病例中T-SPOT.TB陽性35例，18例非肺結核病例陽性1例，與臨床診斷結果相比，一致性一般(Kappa值為0.54)。49例肺結核病例中FQ-PCR陽性30例，18例非肺結核病例陽性結果為0，與臨床診斷結果相比，一致性一般(Kappa值為0.46)。49例肺結核病例中結核菌培養(yǎng)陽性8例，與臨床診斷結果相比，一致性差(Kappa值為0.09)。49例肺結核病例中病理活檢46例，陽性21例，18例非肺結核病例中病理活檢16例，陽性結果為0,一致性差(Kappa值為0.29)。

表1 T-SPOT.TB、FQ-PCR、結核菌培養(yǎng)和病理活檢分別對診斷肺結核的效能分析

2.3 聯(lián)合檢測對診斷肺結核的效能分析 T-SPOT.TB聯(lián)合FQ-PCR檢測：49例肺結核病例中陽性39例，18例非肺結核病例中陽性1例，與臨床診斷結果相比，一致性較好(Kappa值為0.64)。纖維支氣管鏡檢測(FQ-PCR+結核菌培養(yǎng)+病理活檢)：49例肺結核病例中陽性34例，18例非肺結核病例中陽性0例，與臨床診斷結果相比，一致性一般(Kappa值為0.55)。T-SPOT.TB聯(lián)合纖維支氣管鏡檢測：49例肺結核病例中陽性46例，18例非肺結核病例陽性結果為1例，與臨床診斷結果相比，一致性極高(Kappa值為0.85)。見表2。

表2 聯(lián)合檢測對診斷肺結核的效能分析

3 討 論

結核病常用的檢測方法有PPD試驗、痰涂片鏡檢法和培養(yǎng)法，以及結核菌血清學檢測方法等。結核抗體檢測采用ELISA法進行體液檢測，越來越多的研究表明結核抗體的檢測診斷價值有限[3，4]。在結核病的診斷中，結核菌培養(yǎng)陽性被看作是診斷的“金標準”，但由于結核桿菌培養(yǎng)要求高，受標本中結核桿菌數(shù)量的影響，陽性率低[5]，同時繁殖速度慢、周期長，不利于早期診斷。PPD試驗是體內試驗，隨著卡介苗接種的日漸普及，PPD試驗的假陽性增多，而在兒童和免疫抑制的人群中易出現(xiàn)假陰性，因而診斷價值有限。

英國牛津大學于2003 年開發(fā)的結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)是一種新型的利用結核菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10 作為刺激物、應用酶聯(lián)免疫斑點技術檢測結核菌致敏T淋巴細胞的結核感染診斷方法，為體外實驗，較PPD體內試驗相比，結果更加客觀和準確，國內外報道具有高度的敏感度和特異度[6～8]，且在免疫力低下的人群中，T-SPOT.TB 依然能夠維持較高的敏感性和特異性[9]。

目前纖維支氣管鏡在支氣管內膜結核的診斷中價值越來越被重視。纖維支氣管鏡檢查可以直觀地看到氣管、支氣管內病灶。本研究中，纖維支氣管鏡下可見，支氣管結核(EBTB)病變部位廣泛，除肺結核的好發(fā)部位雙肺上葉尖后段和下葉背段外，其他部位也常被累及。EBTB的鏡下形態(tài)多樣化，可能與疾病發(fā)展過程中的不同階段有關。炎性浸潤型EBTB與支氣管黏膜細菌性炎癥鏡下表現(xiàn)相似，不易區(qū)分，而干酪壞死型、肉芽增殖型和瘢痕狹窄型要與兒童肺部腫瘤性疾病，包括其他部位腫瘤在肺部的浸潤相區(qū)別。但兒童腫瘤性疾病發(fā)病率遠低于成人，因此纖維支氣管鏡下這三種類型的表現(xiàn)均應高度警惕結核。借助纖維支氣管鏡確診病原學方法有BALF結核菌培養(yǎng)和熒光定量PCR、活檢病理等。纖維支氣管鏡直接取材于病變部位，加之其機械性刺激，在刷檢之后沖洗，獲得結核分枝桿菌的機會增多，且可減少口咽部對標本的污染，陽性率和準確率都比較高[10]。

熒光定量PCR(FQ-PCR)是一種新的核酸定量技術，在體外由引物介導的特異DNA序列的酶促擴增技術的基因診斷方法。主要是在一定的反應體系中通過首先查找到樣本中結核分枝桿菌本身的基因，進而對其基因上某些高保守的特定區(qū)段進行體外快速、高保真的復制增殖，使其迅速被放大到巨大的信號量而能夠被檢測到。具有較高的靈敏度和特異度,有非常實用的價值[11，12]。支氣管肺泡灌洗液直接取材于病變部位，通過纖支鏡負壓吸出，避免了其他菌的污染，準確性高，陽性率也明顯高于痰液及外周血[13]。

我們研究顯示單項檢測結核菌培養(yǎng)雖特異度高(100.0%),但敏感度最低(16.3%)，Youden指數(shù)為0.16,與臨床診斷結果相比，該方法的一致性差(Kappa值為0.09)，且周期長，不利于早期診斷。病理活檢特異度高(100.0%),敏感度為45.6%，Youden指數(shù)為0.46,與臨床診斷結果相比，一致性差(Kappa值為0.29)。且病理活檢時，有5例患兒因新生物血管豐富，局部黏膜糜爛觸之易出血而未敢進行，部分患兒經(jīng)過多次、多部位活檢才確診，這可能與取材的部位、大小及操作者的技術水平及相互配合有關。

T-SPOT.TB和FQ-PCR單項檢測，與臨床診斷結果相比，一致性均為一般(Kappa值分別為0.54和0.46),當然樣本量偏少也可能會有一定的誤差。聯(lián)合檢測：纖維支氣管鏡檢測(FQ-PCR+結核菌培養(yǎng)+病理活檢)敏感度為69.4%，特異度為100.0%， Youden指數(shù)0.69,臨床診斷結果相比，一致性一般(Kappa值為0.55)；T-SPOT.TB聯(lián)合FQ-PCR檢測，敏感度為79.5%，特異度為94.4%， Youden指數(shù)0.74,臨床診斷結果相比，一致性較好(Kappa值為0.64)，提示兩者聯(lián)合在一定程度上可彌補病理活檢在上述情況下的不足，有一定的診斷價值。當然，T-SPOT.TB與纖支鏡的聯(lián)合檢測敏感度為93.8%，特異度為94.4%， Youden指數(shù)0.88，與臨床診斷結果相比，一致性極高(Kappa值為0.85)，對肺結核診斷意義更大。

綜上，對于臨床上高度懷疑肺結核的患兒，行T-SPOT.TB聯(lián)合纖維支氣管鏡檢查，不但形態(tài)學上可以給予提示，病原學確診早期主要有賴于BALF的FQ-PCR和病理活檢。T-SPOT.TB聯(lián)合 FQ-PCR檢測可提高結核病患兒的診斷率，操作簡便，易于掌握，對患兒損傷小、風險也小，可彌補病理活檢在某些情況下的不足，有一定的診斷價值。T-SPOT.TB聯(lián)合纖支鏡檢對肺結核的診斷意義更大。當然到目前為止，對于兒童肺結核的診斷還在不斷探索，隨著樣本量擴大還需要進一步的研究。

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TheclinicalapplicationofT-SPOT.TBtestcombiningwithfiberopticbronchoscopyexaminationindiagnosisofchildhoodpulmonarytuberculosis

MENGYanni,CHENYanping,LIXiulong,HUANGJianBao.

TheSecondDepartmentofRespiratory,HunanChildrenHospital,Changsha410007,China

ObjectiveTo evaluate tuberculosis infection in T cells spot test (T-SPOT.TB) combined with fiberoptic bronchoscopy in the diagnosis of children pulmonary tuberculosis.MethodsFrom 2010 March to 2012 Decemberc, 67 cases of children with suspected pulmonary tuberculosis in our hospital were examined by PPD test, ESR, CT, chest T-spot. TB testing, bronchoscopy (including lavage of Mycobacterium tuberculosis culture, fluorescence quantitative PCR and pathological biopsy) check.ResultsAfter checking, pulmonary tuberculosis were diagnosed in 49 cases, chronic or persistent pneumonia in 9 cases, 7 cases of cough variant asthma, 1 cases of bronchial foreign body, 1 cases of lymphoma. Fiberoptic bronchoscopy showed that inflammatory infiltration type in 18 cases (36.7%), 5 cases of caseous necrosis type (10.2%), proliferation of granulation type in 11 cases (22.5%), 15 cases of cicatricial stenosis (30.6%). compared single detection of mycobacterium tuberculosis culture and pathological biopsy with clinical diagnosis, poor consistency were found (Kappa = 0.09, Kappa=0.29), compared the T-SPOT.TB and FQ-PCR single detection with the clinical diagnosis, general consistency were found (Kappa = 0.54, Kappa= 0.46). Joint detection: compared fiberoptic bronchoscopy examination (FQ-PCR + Mycobacterium tuberculosis culture + biopsy) with the clinical diagnosis, general consistency were found (Kappa = 0.55); T-SPOT.TB combined with FQ-PCR detection, good agreement were found (Kappa = 0.64), T-SPOT.TB combined with bronchoscopy resulted very high consistency (Kappa = 0.85).ConclusionIt demonstrated that the T-SPOT.TB bronchoscopy is effective means for diagnosis of pulmonary tuberculosis.

Pulmonary tuberculosis; Tuberculosis infected T cells spot test; Fiberoptic bronchoscopy

410007 長沙，湖南省兒童醫(yī)院呼吸二科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.09.010

2014-06-15)