劉忠和, 余 薇, 劉 超, 吳基良

(1咸寧市中醫(yī)院內(nèi)科, 2湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室， 湖北 咸寧 437100)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病引起的一種心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙，獨立于高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心臟瓣膜病及其它已知心臟疾病[1]。DCM引起舒張期和(或)收縮期心功能改變，最終可能引發(fā)心肌缺血和心衰，成為糖尿病患者的重要致死原因之一。DCM的發(fā)病機理目前尚不完全清楚，心肌細胞糖脂代謝紊亂、炎癥、氧化應激、心肌纖維化、心肌細胞凋亡以及線粒體損傷被認為是DCM發(fā)生和發(fā)展的可能機制[2]。姜黃素(curcumin，Cur)是從姜科植物中提取的一種黃色酚類化合物，現(xiàn)代藥理學研究表明姜黃素能通過疏水性作用同血漿白蛋白結(jié)合運輸，易于滲透細胞質(zhì)，富集于膜性結(jié)構(gòu)如質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂和抗微生物等藥理作用[3]。為此，本研究通過復制2型糖尿病大鼠模型，探討姜黃素對大鼠糖尿病心肌病的保護作用及可能機制。

材 料 和 方 法

1 儀器與試劑

血糖測試儀(長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司)；pH計(Mettler Toledo公司)；3-18K高速冷凍離心機(Sigma)；自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)。

姜黃素(陜西森弗生物技術(shù)有限公司)；鏈脲佐菌素 (streptozotocin,STZ;Sigma)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測試盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)測試盒(南京建成研究所)；心肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)；β-actin和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)α抗體(Santa Cruz)；其余均為進口或者國產(chǎn)分析純化學試劑。

2 動物分組及給藥

雄性SPF級Wistar大鼠，體重70～90 g[湖南省實驗動物中心(SCXK 2009-0012)]。適應性喂養(yǎng)1 周，動物飼養(yǎng)在溫度控制在(22±2)℃、濕度為40%的SPF級動物房，并保持12 h的晝夜節(jié)律和自由進食進水。實驗方案經(jīng)過華中科技大學同濟醫(yī)學院動物倫理委員會批準，批準號為2011-S238。

適應性喂養(yǎng)1周后，動物隨機分為正常對照組(control組，n=10)和糖尿病模型組(n=65)。正常對照組大鼠給予標準普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病模型組大鼠以高糖高脂飼料(在普通飼料的基礎上加入20%蔗糖和20%豬油)喂養(yǎng)。飼養(yǎng)8 周后，禁食12 h，糖尿病模型組大鼠一次性腹腔注射小劑量STZ 40 mg/kg，用pH 4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解配制)，正常對照組大鼠腹腔注射等容量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。STZ腹腔注射3 d和7 d后，禁食12 h，鼠尾取血測定空腹血糖。糖尿病模型成功大鼠診斷標準為：連續(xù)2次空腹血糖 ≥11.6 mmol/L，未達成模標準者剔除。糖尿病模型成功大鼠隨機分為DCM組 (n=20)、Cur小劑量治療組(DCM+Cur 100 mg/kg組，n=12)和Cur大劑量治療組(DCM+Cur 200 mg/kg組，n=12)。Cur小劑量和大劑量組每日分別經(jīng)口灌胃(ig)Cur 100 mg/kg和200 mg/kg。正常對照組和DCM組大鼠每日ig等容量羥甲基纖維素鈉。繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)16周，每2周禁食12 h，鼠尾取血檢測空腹血糖1次。實驗期間動物自由進水，未使用胰島素及其它降糖藥物。

3 主要方法

3.1血清中cTnI含量測定 實驗末，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，取上清，按照酶聯(lián)免疫分析法檢測cTnI含量。

3.2心肌組織中MDA含量和GSH-Px活力測定 藥物治療16周后取出心臟，制備成心臟勻漿，提取上清，按照試劑盒相關(guān)程序操作。

3.3Western blotting檢測心肌組織中PKC表達 取100 mg左心室組織置于EP管中，按照體重∶體積=1∶9的比例加入900 μL組織裂解液，冰上勻漿后，13 000 r/min、4 ℃離心15 min后，取上清液，按BCA法測定蛋白濃度。用微量進樣器上樣后，濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為100～120 V電泳，至溴酚藍到凝膠底部。用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜后5%脫脂牛奶室溫封閉。加入用TBST適當稀釋的Ⅰ抗PKCα(1∶200)和β-actin(1∶500)，置于4 ℃冰箱過夜后，加入HRP標記的羊抗兔的IgG抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST漂洗后，加入ECL熒光液，用SYNGENE自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白表達情況。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件分析，行One-way ANOVA檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 實驗動物的基本情況

整個實驗期間，正常對照組大鼠毛色光白，活潑易動，雙眼靈活有神；糖尿病組大鼠毛色逐漸失去光澤直至灰暗，消瘦，精神萎靡，行動遲緩，部分大鼠出現(xiàn)爛尾現(xiàn)象，其中有3只出現(xiàn)糖尿病性白內(nèi)障。Cur大劑量治療組大鼠毛色有光澤，對周圍變化反應靈敏，精神狀態(tài)較糖尿病組明顯好轉(zhuǎn)。

2 動物體重的變化

注射STZ之前，4組之間比較體重無顯著差異(P>0.05)。注射STZ后1周即藥物治療前，與正常對照組比較，各造模組大鼠體重開始下降，顯著差異(P<0.05)。實驗末，與正常對照組相比，糖尿病大鼠體重均下降明顯(P<0.05)。但與糖尿病組比較，Cur大劑量治療組大鼠體重顯著升高(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Effect of curcumin (Cur) on body weight of STZ-induced diabetic rats.Mean±SEM.n=8～12.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs DCM group.

3 動物血糖的變化

如圖2所示,注射STZ之前，4組之間比較空腹血糖無顯著差異(P>0.05)。注射STZ后1周即藥物治療前，糖尿病模型成功大鼠空腹血糖較正常對照組大鼠均明顯升高(P<0.05)。實驗末，糖尿病組大鼠空腹血糖呈持續(xù)性升高，與正常對照組比較明顯增高(P<0.05)，而Cur各治療組空腹血糖較糖尿病組顯著降低(P<0.05)。

Figure 2. Effect of curcumin (Cur) on fasting blood glucose in STZ-induced diabetic rats.Mean±SEM.n=8～12.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs DCM group.

4 心肌組織中GSH-Px活性以及MDA含量的變化

與正常對照組比較，糖尿病組GSH-Px活性顯著下降，而MDA含量顯著升高(P<0.05)。Cur治療后可呈劑量依賴性地升高心肌GSH-Px活性，同時降低MDA含量(P<0.05)，見表1。

5 血清中cTnI含量的變化

與正常對照組比較，糖尿病組大鼠血清中cTnI含量顯著升高(P<0.05)，Cur可顯著降低糖尿病大鼠血清cTnI的含量(P<0.05)，見表1。

表1 Cur對STZ所誘導的糖尿病大鼠cTnI、MDA含量以及GSH-Px活力的影響

6 心肌組織中PKC的變化

如圖3所示，與正常對照組比較，糖尿病組大鼠心肌組織中PKCα表達顯著增加，而Cur大劑量治療組可逆轉(zhuǎn)糖耐所致的PKCα表達增加(P<0.05)。

討 論

在本實驗中，我們首次選擇70～90 g左右的Wistar大鼠給予高糖高脂飲食8周造成胰島素抵抗后，小劑量STZ(40 mg/kg)一次性腹腔注射，成功地復制出2型糖尿病大鼠模型。我們采用的糖尿病大鼠診斷標準為連續(xù)2次測定空腹血糖≥11.6 mmol/L為模型成功大鼠。糖尿病大鼠在給予STZ腹腔注射72 h后空腹血糖開始增加，并在隨后的整個實驗過程中呈現(xiàn)出持續(xù)的高血糖，表現(xiàn)出高血糖所致的葡萄糖代謝紊亂。糖尿病大鼠經(jīng)過姜黃素治療后可顯著降低動物空腹血糖，改善動物的體重減輕的癥狀。

肌鈣蛋白(troponin，Tn)是橫紋肌收縮的重要調(diào)節(jié)蛋白，由肌鈣蛋白C(TnC)、肌鈣蛋白T(TnT)和肌鈣蛋白I(TnI)3個亞基組成。TnI也有3種亞型：快骨骼肌亞型、慢骨骼肌亞型和心肌亞型。cTnI僅存于心肌細胞中，為心肌特異型的肌鈣蛋白，參與鈣離子誘導的肌肉收縮，其敏感性和特異性比CK-MB高，是高度特異和靈敏的反映心肌細胞損傷壞死的標志物[4]。有文獻報道，糖尿病大鼠6周即出現(xiàn)糖尿病性心肌損傷。在本研究中，我們觀察到糖尿病大鼠血清cTnI的釋放明顯增加，而姜黃素可逆轉(zhuǎn)cTnI水平改變，表明姜黃素可抑制糖尿病所致的心肌損傷。

Figure 3. Curcumin (Cur) decreased PKCα expression in the rat hearts with STZ-induced diabetic cardiomyopathy.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs DCM group.

正常情況下活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)能被體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)如SOD、GSH-Px等和非酶系統(tǒng)如維生素E和維生素C清除，使體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡中，維持細胞內(nèi)ROS處于穩(wěn)定水平[5]。然而，糖尿病時ROS還可通過脂質(zhì)β氧化、葡萄糖自身氧化代謝等多種途徑產(chǎn)生，因此糖尿病時心肌可產(chǎn)生更多ROS從而造成細胞DNA損傷和細胞凋亡[6]。測定MDA含量的變化以及抗氧化酶GSH-Px活力可反映心肌細胞脂質(zhì)過氧化程度。據(jù)報道Cur具有較強的抗氧化能力，幾乎是天然抗氧化劑維生素E的10倍左右[7]。實驗中我們發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌組織GSH-Px活力顯著降低而MDA含量顯著增高，給予Cur治療后心肌GSH-Px活力顯著升高，而脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA顯著下降，表明Cur具有較強的抗氧化能力。

PKC是一種鈣、磷脂依賴性蛋白磷酸化酶，具有多種亞型，在靜息狀態(tài)下主要以無活性的形式存在于胞漿中，是細胞內(nèi)信息傳遞的重要分子[8]。當體內(nèi)氧化應激增強時，活化的PKC通過使心肌Na+-K+-ATP酶、肌鈣蛋白、微管蛋白等底物蛋白磷酸化，進而抑制肌原纖維ATP酶的活性，從而影響心肌收縮力和舒張功能[9]。在本研究中我們觀察到糖尿病大鼠心肌組織中PKCα的表達明顯增加，而Cur治療后可顯著減少心肌PKCα的表達。

綜上所述，Cur對2型糖尿病大鼠心肌病具有保護作用，其機制可能與抑制氧化應激、下調(diào)心肌PKCα表達有關(guān)，本研究為尋求開發(fā)新的抗糖尿病心肌病的藥物提供了新的思路。

[參 考 文 獻]

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