龐 卯， 楊 陽， 劉 斌， 張良明， 戎利民

(中山大學附屬第三醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510630)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是一種常見的中樞神經(jīng)損傷，通常導致四肢軀干運動和感覺功能的部分喪失，甚至截癱。目前脊髓損傷的治療仍然是一個世界性的問題[1-2]。細胞移植治療為脊髓損傷的修復提供了一種新的方法，常用的可供移植的細胞有神經(jīng)干細胞、雪旺細胞、嗅鞘細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞[1]。因涉及到從人類胚胎或其它組織中獲取細胞，故同種異體免疫排斥和倫理問題是限制其臨床應(yīng)用的主要障礙[3]。獲得一種既能夠多能性分化，又可避免免疫排斥反應(yīng)的干細胞對于脊髓損傷的治療具有重要的意義。誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)給我們提供了一個新策略[4]。Takahashi等[5]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移至小鼠成纖維細胞中，首次獲得iPSCs。先前的研究也指出iPSCs可以分化為神經(jīng)干細胞以及進一步分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞[6-7]。因此，在脊髓損傷的實驗性自體細胞移植治療中，iPSCs顯示出了廣闊的前景[8]。已有報道不同來源的iPSCs可以分化為神經(jīng)元，但分離過程較為冗繁[7,9]。本文旨在前期研究的基礎(chǔ)上探討如何大量、穩(wěn)定、簡便地將iPSCs定向分化為神經(jīng)元，從而為其巨大治療潛能的發(fā)揮奠定體外實驗基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

小鼠iPSc細胞系購自中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(non-essential amino acid, NEAA)、N2添加物(N2 supplement)、B27添加物(B27 supplement)、含有EDTA的胰酶、β-巰基丙醇、明膠溶液、Neurobasal培養(yǎng)基和ITS-A(insulin-transferrin-selenium-A)添加物均購自Gibco；白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)購自Millipore；維甲酸(retinoic acid,RA)購自Sigma；堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)購自Peprotech；兔抗小鼠Oct4、Sox2和SSEA1抗體購自Santa Cruz；兔抗小鼠巢蛋白(nestin)單克隆抗體購自Abcam；兔抗小鼠微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)單克隆抗體購自Millipore；兔抗小鼠膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)單克隆抗體和兔抗小鼠髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)單克隆抗體購自北京博奧森生物公司；FITC標記驢抗兔IgG購自Life；FITC標記羊抗兔IgG購自Abgent；0.1% Triton X-100穿膜劑購自天津光復精細化工研究所；6%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液購自廣州碧云天生物公司；染核試劑Hoechst 33342購自廣州齊云生物公司；甲醇和磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline solution,PBS)購自廣州化學試劑廠。

2 方法

2.1培養(yǎng)基 小鼠iPSCs培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基、15%胎牛血清、1%非必須氨基酸、1 mmol/L L-谷氨酰胺、1%β-巰基乙醇和0.1%LIF。擬胚體(embryoid body, EB)培養(yǎng)基：不含LIF的iPSCs培養(yǎng)基。神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)誘導培養(yǎng)基： Neurobasal培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、1% N2 supplement、2% B27 supplement 和1% ITS-A。NSCs培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基、2 mmol/L GlutaMAX、2% B27 supplement 、20 μg/L bFGF和20 μg/L EGF。神經(jīng)元誘導培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基、5%胎牛血清和1 μmol/L RA。小鼠成纖維細胞培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基和10%胎牛血清。

2.2小鼠iPSCs傳代培養(yǎng) 將小鼠的iPSCs接種于經(jīng)10 mg/L絲裂霉素C處理過的第3代小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)飼養(yǎng)層上，使用iPSCs培養(yǎng)基培養(yǎng)。待集落長滿飼養(yǎng)層，用0.25%含有EDTA的胰酶消化，血清終止消化后將集落吹下，加入3～5 mL培養(yǎng)液，輕輕吹散成小集落，均勻接種于飼養(yǎng)層細胞上。

2.3小鼠iPSCs向NSCs的定向分化 取生長狀態(tài)良好的小鼠iPSCs，使用0.25%含有EDTA的胰酶消化，用不含LIF的EB培養(yǎng)基吹打成小的細胞團，接種到低黏附的細菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2 d，觀察EB的形成。收集懸浮培養(yǎng)2 d的EB，用含1 μmol/L RA的EB培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)2 d促進其進一步分化。第5天時將EB置于0.1%明膠溶液包被過的6孔板中，換用NSCs誘導培養(yǎng)基中，隔天換液。7 d后在解剖顯微鏡下使用巴氏管將rosette結(jié)構(gòu)外已“爬出”的細胞分離成“碎片狀”細胞集落甚至單個細胞后，再次轉(zhuǎn)移至低黏附的細菌培養(yǎng)皿中促進神經(jīng)球(neurosphere)形成。

2.4小鼠NSCs向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞的分化 NSCs懸浮培養(yǎng)7 d后，將其轉(zhuǎn)移至含1 μmol/L RA及胎牛血清的分化培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察誘導后細胞的形態(tài)變化。

3 iPSCs及其分化的神經(jīng)譜系鑒定

3.1iPSCs內(nèi)干細胞特異性標志物堿性磷酸酶檢測 PBS清洗細胞3遍，加入冰甲醇4 ℃環(huán)境中固定細胞10 min；棄除冰甲醇，PBS清洗3遍，每次5 min；加入1 mL AP顯色液，室溫暗盒中靜置15 min，PBS洗2遍后，每孔加入2 mL PBS, 倒置顯微鏡下拍照。

3.2免疫熒光染色檢測Oct4、Sox2、SSEA1、nestin、MAP-2、GFAP及MBP的表達 PBS清洗細胞3遍，加入冰甲醇4 ℃環(huán)境中固定細胞10 min；棄除冰甲醇，PBS清洗3遍，每次5 min；加入0.1% Triton X-100及6% BSA等體積穿膜封閉混合液，室溫避光孵育1 h；PBS清洗3遍，每次5 min，加入兔抗小鼠Oct4 Ⅰ抗(1∶250)、Sox2 Ⅰ抗(1∶250)、SSEA1 Ⅰ抗(1∶250)、nestin Ⅰ抗(1∶1 000)、MAP-2 Ⅰ抗(1∶1 000)、GFAP Ⅰ抗(1∶200)及MBP Ⅰ抗(1∶200)，4 ℃環(huán)境中孵育過夜；第2天吸除 Ⅰ抗溶液，PBS清洗3遍，每次5 min，加入羊抗兔熒光標記Ⅱ抗(1∶50)或驢抗兔熒光標記Ⅱ抗(1∶400)，室溫孵育1 h；吸除Ⅱ抗溶液，PBS清洗3遍，每次5 min，Hoechst 33342染核2～3 min；吸除染核試劑，添加少量PBS后，倒置熒光顯微鏡下觀察。

3.3RT-PCR檢測GFAP、nestin、β3- tubulin、MAP-2及MBP mRNA的表達 引物序列見表1。取貼壁分化后的iPSCs, 無菌PBS洗3遍,常規(guī) Trizol法提取總RNA。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。取9 μL PCR產(chǎn)物于1 μL 10× loading buffer 中，點樣于2%瓊脂糖凝膠電泳，90 V、30 min。紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)(Gel Imaging System)拍照。

表1 引物序列

3.4MAP-2的鑒定 取MAP-2的PCR合成產(chǎn)物，鑒定由上海英濰捷基公司完成。

3.5流式細胞術(shù)檢測分化神經(jīng)干細胞及神經(jīng)元的比例 細胞經(jīng)胰酶消化，重懸，400目濾網(wǎng)過濾，每106個細胞經(jīng)PBS洗滌后使用250 μL固定破膜劑(BD cytofix/cytoperm)，4 ℃孵育20 min。洗滌液清洗細胞2次(BD perm/wash buffer)，每次700×g離心8 min。加入FITC標記的nestin抗體(1∶200)和MAP-2抗體(1∶1 000)，室溫孵育30 min。檢測神經(jīng)元比例的細胞中繼續(xù)加入FITC標記的驢抗兔Ⅱ抗(1∶200)，室溫孵育15 min。吸除抗體，PBS重懸后上機(BD Biosciences)檢測。

結(jié) 果

1 小鼠iPSCs形態(tài)特點及定向分化為NSCs

小鼠iPSCc呈典型的克隆狀生長(圖1A)。克隆呈圓形或類圓形，邊界清晰?？寺?nèi)細胞排列緊密，核大、核仁清晰，細胞核/質(zhì)比高，高倍鏡下形似鳥巢。一般在消化iPSCs后懸浮培養(yǎng)的第2天可見到EB形成 (圖2A1、A2)，EB內(nèi)細胞間黏附緊密，各EB邊界清楚，表面不光滑，胚體飽滿，懸浮生長于培養(yǎng)液中。將EB置于含RA的培養(yǎng)基后其形態(tài)無明顯變化，仍呈現(xiàn)圓形或類圓形的懸浮體(圖2A3)；EB貼壁2～3 d后可以觀察到其邊緣逐漸有細胞“爬出”，形成rosette結(jié)構(gòu)(圖2B1)，其細胞形態(tài)與iPSCs明顯不同，細胞體積較小，核仁不大，核漿比較低，隨著時間的延長，其分化細胞數(shù)目逐漸增多，至第7天達到高峰(圖2B2、B3)；在解剖顯微鏡下經(jīng)巴氏管機械分離“爬出”的“碎片”狀細胞集落或單個細胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)2 d后，細胞逐漸聚集，再次形成圓形或類圓形的懸浮細胞聚集體，即神經(jīng)球，其折光性好，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，呈顆粒狀，與EB形態(tài)差異較大(圖2C1～C3)。

Figure 1. Charicteristics and identification of the mouse iPSCs. A: photomicrographs of the iPSCs; B～E: stem cell markers were assessed by immunofluorescence, including Sox2 (B), Oct4 (C), SSEA1 (D), and alkaline phosphatase (ALP; E). Scale bars = 200 μm.

2 小鼠NSCs定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞

懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)3～5 d后即可見有神經(jīng)突起樣的細胞逐漸由其邊緣爬出(圖2D1)，7 d后，可觀察到明顯的神經(jīng)突起樣結(jié)構(gòu)從貼壁的神經(jīng)球中伸出，突起相互交織，形成網(wǎng)絡(luò)；繼續(xù)誘導培養(yǎng)，突起樣結(jié)構(gòu)繼續(xù)增多并延長，向遠處遷移，彼此間形成突觸樣結(jié)構(gòu)(圖2D2)，15 d后高倍鏡下見神經(jīng)元胞體透亮度明顯降低，神經(jīng)元趨于老化(圖2D3)。

3 iPSc及其分化細胞上特異性表面標志物的表達

iPSc細胞株堿性磷酸酶檢測均為強陽性，呈紫紅色，飼養(yǎng)層細胞不著色，說明iPSCs具有較高的干細胞特性(圖1E)。免疫熒光結(jié)果顯示穩(wěn)定傳代后的iPSCs表達干細胞標志物Oct4、Sox2和SSEA1(圖1B～D)；RA誘導后無血清培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)7 d的神經(jīng)球克隆表達NSCs標志物nestin(圖3A)。神經(jīng)球貼壁分化培養(yǎng)后的細胞表達神經(jīng)元標志物(圖3B)、星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP(圖3C)和少突膠質(zhì)細胞標志物MBP(圖3D),證實神經(jīng)干細胞已分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。

Figure 3. Immunofluorescence of mouse neurospheres and their differentiated derivatives. Neurospheres, neurons, oligodendrocytes, and astrocytes were assessed by immunofluorescence for nestin (A), MAP-2 (B), GFAP (C), and MBP (D). Scale bars =200 μm (A, C), 100 μm (B), and 50 μm (D).

4 神經(jīng)球貼壁分化后GFAP、nestin、β3-tubulin、MAP-2和MBP mRNA測定及MAP-2基因的鑒定

RT- PCR結(jié)果顯示神經(jīng)球貼壁分化培養(yǎng)后的細胞分別表達神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞標志物GFAP、β3-tubulin、MAP-2、和MBP，未表達神經(jīng)干細胞標志物nestin(圖4A)，表明神經(jīng)干細胞已完全分化；基因鑒定結(jié)果顯示MAP-2 PCR產(chǎn)物與GenBank基因庫中小鼠MAP-2基因相符合(圖4B)。

Figure 4. Sequencing result of MAP-2 gene RT-PCR product in the cells differentiated from the mouse iPSC-derived neurospheres.

5 流式細胞術(shù)檢測細胞比例

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示分化細胞中神經(jīng)干細胞和神經(jīng)元的比例分別為(63.93±1.47)%和(21.40±1.70)%，見圖5。

Figure 5. Flow cytometric analysis of the markers nestin and MAP-2 in the differentiated cells.

討 論

目前對于神經(jīng)系統(tǒng)損傷性及退行性疾病，臨床上尚無安全有效的新方法，而再生醫(yī)學的快速發(fā)展為此類疾病的治療提供了新希望[10]，iPSCs作為再生醫(yī)學中一個新興的成員，它的相關(guān)理念與技術(shù)在數(shù)年間迅猛發(fā)展，其應(yīng)用前景也越來越廣闊[11-12]。利用iPSCs的多能分化性可將其定向分化為NSCs及神經(jīng)元，而NSCs可塑性較強，移植入神經(jīng)組織中根據(jù)局部的信號刺激可分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞，從而發(fā)揮重建信號轉(zhuǎn)導通路進而恢復神經(jīng)功能的作用[6-7, 9]，有望成為治療脊髓損傷新興的種子細胞。

本實驗充分證明了體外合適的誘導環(huán)境可以將iPSCs定向分化為NSCs及神經(jīng)元，從而為iPSCs潛在治療效能的實現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。我們在iPSCs向NSCs定向分化后，采用機械分離法將rossette結(jié)構(gòu)外圍的細胞集落盡量分散成碎片或單個細胞，簡化了操作。因在解剖顯微鏡下操作，故需注意無菌原則，同時需細致分離以避免細胞污染。我們在實驗中加用了經(jīng)典的神經(jīng)誘導劑RA，其在神經(jīng)細胞的發(fā)育、再生和維持中發(fā)揮重要的作用，它能夠抑制前部轉(zhuǎn)錄因子的表達，同時激活后部轉(zhuǎn)錄因子的表達[13]。

本實驗所用iPS為病毒誘導而來，其本身存在潛在的致瘤風險，未在動物體內(nèi)行移植檢測是不足之處，后續(xù)實驗擬使用安全性更高的穿膜蛋白[14]誘導iPSCs，并行神經(jīng)細胞定向分化以及體內(nèi)實驗驗證。我們在iPSCs定向分化過程中經(jīng)過了EB中間狀態(tài)，而Hester等[9]使用神經(jīng)源素2(neurogenin 2, NGN2)、胰島素基因增強結(jié)合蛋白1(islet-1, ISL-1)和LIM/同源框蛋白3(LIM/homeobox protein 3, LHX3)從iPSCs誘導至神經(jīng)前體細胞(neural progenitor cells, NPCs)再定向分化為運動神經(jīng)元(motor neurons, MN)，不經(jīng)過EB中間狀態(tài)。另有研究顯示在不同的誘導條件跳過iPSCs和NSCs過程直接將小鼠和人的成纖維細胞分別重編程為多巴胺能神經(jīng)元和脊髓運動神經(jīng)元[15-16]，均簡化了誘導過程。但iPSCs或成纖維細胞分化而來的神經(jīng)元修復脊髓損傷的作用仍需進一步動物實驗以及未來臨床實驗證明，同時仍需優(yōu)化誘導條件及流程，使得iPSCs真正成為修復脊髓損傷的理想種子細胞。

[參 考 文 獻]

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