杜月光， 柴可夫， 錢俊文， 章科娜

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 1病理學(xué)教研室, 2中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所，浙江 杭州 310053)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病的主要原因。目前認為糖脂代謝紊亂引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)病中起重要作用，并成為DN防治的重要靶點[1]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；福c細胞衰老、壽命延長、抗氧化應(yīng)激和能量代謝調(diào)節(jié)等細胞多種功能活動有關(guān)[2]。研究表明SIRT1可使NF-κB RelA/p65 亞單位去乙?；?，進而抑制NF-κB活性，從而起到抗炎作用[3-4]，因此研究認為SIRT1可作為抗炎治療的潛在靶點。本項目通過高糖刺激大鼠腎小球系膜細胞，觀察在系膜細胞高糖應(yīng)激過程中SIRT1的表達變化，并通過SIRT1的激活劑和RNAi干擾技術(shù)影響SIRT1表達，觀察其對氧化應(yīng)激及炎癥因子的影響，從而探討SIRT1在系膜細胞高糖應(yīng)激損傷中的作用，為進一步研究其在糖尿病腎病中的作用奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠腎小球系膜細胞株(rat mesangial cells, RMC)由杭州市中醫(yī)院腎病中心惠贈；限制性內(nèi)切酶AgeⅠ/EcoRⅠ和T4 DNA 連接酶(NEB)；慢病毒載體系統(tǒng)包括pTRC-EGFP、pHelper1.0和pHelper2.0載體(杭州浩基生物公司)；質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Qiagen)；SuperscriptTMII RTase(Invitrogen)；實時熒光定量PCR試劑盒SYBR? Premix Ex TaqTMPerfect Real Time(Takara)；總超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒(NBT法，碧云天公司)；丙二醛(malondialdehyde,MDA)(Uscn E90597Ge)；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天公司)；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)(MB100B)、血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1-1)(MVC00)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattratant protein 1,MCP-1)(MJE00)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)(RTA00)ELISA檢測試劑盒(R&D)；抗SIRT1抗體(Abcam)；抗乙?；疦F-κB p65 抗體(Santa Cruz)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 RMC用含10% FBS和青、鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)。構(gòu)建pTRC-shSIRT1質(zhì)粒，應(yīng)用Superfectin II轉(zhuǎn)染試劑將pTRC-shSIRT1轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，離心及過濾去除上清液中的細胞碎片后，收集病毒液，之后將適量逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染至RMC，并以2 mg/L polybrene 提高轉(zhuǎn)染效率。

2.2分組及干預(yù) 實驗按以下分組處理：正常對照組(含1 g/L 葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)、甘露醇組(含27.8 mmol/L甘露醇的DMEM 培養(yǎng)液)、高糖組(含4.5 g/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)液)、白藜蘆醇組(用1 μmol/L白藜蘆醇的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng))和SIRT1 RNAi組(添加干擾病毒感染24 h后，換用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng))。

2.3MTT比色法檢測細胞活性 選擇對數(shù)生長終末期，且生長狀態(tài)良好的RMC，按照5×106/L的密度接種到96孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)。更換培養(yǎng)基為無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 按要求分組處理。在避光條件下，每孔加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL Formanzan溶解液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育一定時間后，使紫色結(jié)晶全部溶解，于酶標(biāo)儀上測定570 nm 處的吸光度(A) 值。

2.4細胞SOD含量的檢測 收集細胞，用細胞裂解液裂解細胞，4 ℃離心，收集上清液,按照SOD檢測試劑盒說明書操作，測定SOD活性。

2.5ELISA檢測細胞上清液MDA、MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1的含量 收集細胞培養(yǎng)上清液，按照MCP-1、VCAM-1、TNF-α、TGF-β1和MDA ELISA試劑盒說明書操作，測定各指標(biāo)濃度。

2.6Real-time PCR檢測SIRT1、MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1mRNA轉(zhuǎn)錄水平 收集細胞用Trizol提取RNA，測定并計算RNA的純度和濃度；取RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。用SYBR Green嵌合熒光法進行實時PCR擴增。采用Primer Premier 6.0和Beacon Designer軟件進行熒光引物的設(shè)計，由上海生物工程有限公司負責(zé)合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

反應(yīng)體系中包括:ddH2O 10.5 μL，SYBR Premix EX TaqTM(2×) 12.5 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，總體系量25 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 1 min,95 ℃ 10 s,62 ℃ 25 s,共進行45個循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光度。每個樣品重復(fù)3次。取其循環(huán)閾值(Ct)均值，分別計算各組的ΔCt(Ct內(nèi)參照基因-Ct目的基因)，再以正常組細胞為1進行均一化，以2-ΔΔCt表示基因的相對表達水平。

2.7Western blotting法檢測SIRT1和乙?；疦F-κB蛋白的表達 采用總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，用BCA法對提取的蛋白進行濃度測定。取60 μg總蛋白進行SDS-PAGE。電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜放入T-TBS(含5%脫脂奶粉)封閉1 h后，分別加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜(SIRT1 1∶1 000,乙?；疦F-κB 1∶500)洗膜，然后用Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，在暗室中用增強化學(xué)發(fā)光檢測試劑顯色，拍片晾干，計算機掃描，采用Bandscan 5.0軟件分析條帶的吸光度。目的蛋白相對表達量=目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照β-actin吸光度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析比較各組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組細胞活力比較

高糖刺激造成RMC的活力下降，和正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)。白藜蘆醇干預(yù)可有效抑制高糖誘導(dǎo)引起的細胞活力下降(P<0.05)。SIRT1干擾可引起RMC的活力降低，和正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The viability of RMC with different treatments.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control;△△P<0.01 vs high glucose.

2 各組細胞MDA含量及SOD活性的比較

高糖誘導(dǎo)引起RMC MDA分泌增加，SOD活性降低，和正常對照組比較有顯著差異(分別P<0.05和P<0.01)。白藜蘆醇可以保護細胞的SOD活性，抑制高糖刺激引起的MDA分泌(P<0.01)。SIRT1 RNAi使高糖誘導(dǎo)的RMC MDA含量增加，SOD活性降低，和正常對照組比較有顯著差異(P<0.05)，見表2。

3 各組細胞SIRT1、MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1 mRNA 表達的比較

高糖刺激造成RMC的MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1mRNA表達上升，與正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)。白藜蘆醇可以抑制高糖刺激引起的MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1mRNA表達上升(P<0.01)。SIRT1 RNAi引起RMC的MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1mRNA表達上升，和正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖2。

表2 各組細胞MDA含量及SOD活性的比較

Figure 2. The mRNA expression of SIRT1, MCP-1, TGF-β1, VCAM-1 and TNF-α in RMC with different treatments.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control; △△P<0.01 vs high glucose.

4 各組細胞上清液中MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1蛋白含量的比較

高糖刺激引起細胞分泌MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1增加，和正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)。白藜蘆醇預(yù)處理后，可以抑制高糖刺激引起的MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1含量的增加(P<0.01)。SIRT1干擾引起MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1的表達上升，和正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖3、4。

Figure 3. The protein concentrations of MCP-1, TNF-α and TGF-β1 in the RMC culture supernatant.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs Control; △△P<0.01 vs high glucose.

Figure 4. The protein concentration of VCAM-1 in the culture supernatant of RMC with different treatments.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control;△△P<0.01 vs high glucose

5 各組SIRT1蛋白和乙?；疦F-κB蛋白的表達

高糖誘導(dǎo)可使細胞表達SIRT1蛋白降低，乙?；疦F-κB蛋白表達增加(P<0.01)。白藜蘆醇可以促進SIRT1蛋白的表達，使NF-κB p65乙?；浇档?P<0.01)。SIRT1干擾可使高糖誘導(dǎo)的RMC SIRT1蛋白表達減少，乙?；疦F-κB p65蛋白表達增加，和正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖5。

Figure 5. The protein expression of SIRT1 and acetylated NF-κB p65 in RMC with different treatments. 1: control group; 2: mannitol group; 3: high glucose group; 4: resveratrol group; 5: SIRT1 RNAi group. **P<0.01 vs control;△△P<0.01 vs high glucose.

討 論

DN是糖尿病的微血管并發(fā)癥，也是引起終末性腎病的主要原因，已成為全球日益關(guān)注的公共健康問題。糖尿病腎病主要以毛細血管基底膜增厚及腎小球和腎小管間質(zhì)細胞外基質(zhì)進行性積聚為主要病理改變。其發(fā)病機制復(fù)雜，尚未完全闡明。

目前已經(jīng)明確，高糖是引起糖尿病并發(fā)癥包括糖尿病腎病的始動因素。高糖介導(dǎo)引起的晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)大量產(chǎn)生，甘油二脂/蛋白激酶C活性的提高，多元醇通路的激活等是引起DN的經(jīng)典途徑。除此之外，越來越多的證據(jù)表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是引起腎損傷的主要介質(zhì)。因此目前治療DN的主要手段：在降糖基礎(chǔ)上，抑制RAS活化，但在DN的臨床治療中發(fā)現(xiàn)以上的治療，并不能有效地控制其發(fā)展的進程[5]。近幾年的研究表明，炎癥是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]，NF-κB及許多炎癥因子均發(fā)揮致病作用。我們的前期實驗研究顯示[6]，高脂高糖加小劑量STZ復(fù)制的2型糖尿病大鼠，隨著病變的加重，腎臟組織出現(xiàn)炎細胞的浸潤，大鼠血清ICAM-1、MCP-1和TNF-α的含量增加。本實驗結(jié)果顯示，高糖可引起系膜細胞活力下降，氧化應(yīng)激加強，炎癥因子MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1表達增加，也進一步證實炎癥在糖尿病腎病中的損傷作用。

NF-κB是一種介導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7]。眾多研究表明，NF-κB與糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān)[8-9]：在糖尿病狀態(tài)下，高血糖、AGEs、血管緊張素Ⅱ及氧化應(yīng)激等均可激活NF-κB。NF-κB 激活導(dǎo)致多種炎癥因子、細胞因子及黏附分子等表達分泌異常，進而引起腎小球血管通透性增加、腎組織炎細胞浸潤、系膜區(qū)基質(zhì)堆積及腎小管間質(zhì)纖維化。因此，抑制NF-κB的活化在防治糖尿病腎病中具有重要的意義。

NF-κB是由p50和p65兩個蛋白亞基組成的二聚體。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IκB相結(jié)合，使NF-κB以無活性的形式存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細胞受到各種刺激后，IκB 發(fā)生酶解，NF-κB被活化。近年研究表明，NF-κB p65的乙酰化水平調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[10-11]：在p300和CBP的乙?；饔孟?，NF-κB p65 310賴氨酸殘基乙?；琑elA/p65亞單位不能與IκBα結(jié)合，進入核內(nèi)，與DNA相關(guān)元件結(jié)合，刺激相關(guān)基因表達。相反，RelA/p65亞單位的去乙?；?，允許NF-κB/IκBα相互作用，進而抑制NF-κB活性。

SIRT1 是煙堿腺嘌呤二核苷酸依賴性的sirtuin(silent mating type information regulation 2 homolog)去乙酰化酶家族中的一員，在哺乳動物組織中廣泛表達。它不僅調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；€通過表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，參與基因沉默，與細胞衰老、壽命延長、抗氧化應(yīng)激和能量代謝調(diào)節(jié)等細胞多種功能活動有關(guān)，在衰老性疾病和代謝性疾病的組織保護中起重要作用[2]。

越來越多的證據(jù)顯示，SIRT1激活能使NF-κB的RelA/p65亞單位去乙?；种芅F-κB的轉(zhuǎn)錄活性，在炎癥損傷中起保護作用。Jung等[3]研究發(fā)現(xiàn)SIRT1高表達通過降低NF-κB亞單位RelA/p65乙?；瘡亩鴾p輕cisplatin對腎小管細胞的毒性作用；Chen等[4]的實驗發(fā)現(xiàn)高表達SIRT1可通過NF-κB亞單位RelA/p65去乙?；?，顯著降低淀粉樣β 蛋白誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生，并抑制炎癥反應(yīng)對原皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷作用；相反，減少SIRT1使NF-κB p65乙?；撸M而炎癥相關(guān)因子表達增加[12]。另外，研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，限制熱量攝入可通過激活SIRT1進而抑制炎癥和促進自噬改善糖尿病腎??；SIRT1的激活劑白藜蘆醇可減輕高糖誘導(dǎo)的系膜細胞氧化應(yīng)激水平和維持正常的線粒體結(jié)構(gòu)和功能，阻斷氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的系膜細胞凋亡，這提示SIRT1對糖尿病腎臟也具有保護作用，可能是治療糖尿病腎病的有效靶點。但SIRT1的激活是否影響高糖誘導(dǎo)的系膜細胞NF-κB的乙?；郊跋嚓P(guān)因子的分泌，從而起到保護作用，尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高糖誘導(dǎo)的系膜細胞SIRT1表達減少，NF-κB p65的乙?；浇档?。SIRT1的激活劑白藜蘆醇可降低高糖誘導(dǎo)的NF-κB p65的乙?；剑档蚑NF-α、MCP-1、VCAM-1、TGF-β1等炎癥因子的產(chǎn)生；RMC經(jīng)沉默SIRT1處理，可使NF-κB p65的乙?；矫黠@升高。以上結(jié)果提示，SIRT1的激活，對高糖誘導(dǎo)的系膜細胞具有保護作用，其機制可能是SIRT1通過去乙酰化作用于NF-κB的亞單位RelA/p65，減少NF-κB與核內(nèi)炎癥基因結(jié)合，進而減少TNF-α、MCP-1、VCAM-1、TGF-β1等炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，高糖可降低SIRT1水平及活性，引起氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)系膜細胞損傷。SIRT1的激活可以拮抗高糖誘導(dǎo)引起的細胞損傷作用，其機制之一可能使NF-κB 的亞單位RelA/p65去乙?；瑥亩种蒲装Y因子的產(chǎn)生。由此我們相信SIRT1可作為治療DN的潛在靶點。

[參 考 文 獻]

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