杜 濤， 黃 海， 陳 欣， 丁 紅， 張 睿， 劉梅蘭， 陳 慧

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510120)

巨噬細胞是胚胎免疫耐受的核心細胞，流產(chǎn)患者中巨噬細胞的增多并活化是導致流產(chǎn)的主要因素之一[1]。自噬是溶酶體對自身結構的吞噬降解，它既是細胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)，也是機體一種重要的防御和保護機制。在生理狀態(tài)下，自噬作為機體的一種防御機制，在母體對胚胎免疫耐受的發(fā)病機制中具有十分重要作用[2]。自噬在對中樞免疫耐受的誘導中起到關健作用。因此研究母體中巨噬細胞的自噬情況及其調(diào)控機制對自然流產(chǎn)的發(fā)生具有深遠意義。本研究擬通過體外實驗利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬細胞，同時檢測巨噬細胞自噬情況及其經(jīng)典PI3K/Akt/mTOR調(diào)控通路，對流產(chǎn)中母體巨噬細胞自噬的機制進行初步探討。

材 料 和 方 法

1 材料

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；0.25%胰酶(吉瑪公司)；3-磷酸甘油醛脫氫酶(gly-ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體(Santa)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記羊抗兔抗體(ICL)；BCA法蛋白定量試劑盒(上海申能博采)；柯達黑白膠片；增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒(Thermo),超敏ECL試劑盒(Millipore)。

2 方法

2.1實驗分組 將巨噬細胞體外培養(yǎng)，共分為5組，分別檢測不同狀態(tài)下巨噬細胞的自噬情況以及PI3K/Akt/mTOR通路激活狀態(tài)；分別從PI3K及mTOR水平阻斷PI3K/Akt/mTOR通路，檢測巨噬細胞自噬，明確巨噬細胞自噬與PI3K/Akt/mTOR之間的關系。A組：單純小鼠巨噬細胞系RAW264.7 細胞；B組：Earle’s平衡鹽溶液培養(yǎng)的巨噬細胞(饑餓狀態(tài)，激活自噬)；C組：LPS刺激的巨噬細胞；D組：LPS刺激后的巨噬細胞+PI3K抑制劑(hVps34)；E組：LPS刺激后的巨噬細胞+mTOR抑制劑(雷帕霉素)。

2.2各組巨噬細胞體外培養(yǎng) 小鼠巨噬細胞系RAW264.7 細胞購自American Type Tissue Collection(ATCC)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用含10%胎牛血清的DMEM。C組用LPS刺激巨噬細胞，濃度為1 μg/L。D組和E組分別加入hVps34和雷帕霉素阻斷PI3K/Akt/mTOR通路。

2.3穩(wěn)定表達GFP-LC3的RAW264.7細胞系的建立 構建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表達載體，應用轉染技術將該質(zhì)粒導入RAW264.7細胞，用G418篩選穩(wěn)定表達的細胞系。真核細胞中GFP-LC3的表達分別用熒光顯微鏡檢測，并利用該穩(wěn)定表達細胞系觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時細胞發(fā)生自噬的情況。

2.4檢測各組巨噬細胞自噬情況

2.4.1用qRT-PCR方法檢測細胞自噬相關基因的mRNA表達水平 qRT-PCR采用的是LightCycler Real Time PCR擴增儀。用TRIzol從細胞內(nèi)提取總RNA。然后用SuperScript試劑盒合成cDNA。Atg5上游引物5’-TTGACGTTGGTAACTGACAAAGT-3’,下游引物5’-TGTGATGTTCCAAGGAAGAGC-3’;Atg7上游引物5’-GATCCGGGGATTTCTTTCACG-3’,下游引物5’-CAGCAGCTTGGGTTTCTTGAT-3’;LC3-Ⅱ上游引物5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’,下游引物5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’;Bnip3上游引物5’-TGGACGGAGTAGCTCCAAGAG-3’,下游引物5’-CCGACTTGACCAATCCCATATC-3’。

預變性：95 ℃ 30 s；PCR反應： 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40次；熔解曲線分析：95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s。反應結束后確認擴增曲線和熔解曲線。

2.4.2在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白示蹤自噬形成 由于電鏡耗時長，不利于監(jiān)測自噬形成過程，我們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象對此進行觀察。無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。

2.4.3利用Western blotting檢測LC3-II、p-Akt和p-mTOR的表達 將5組細胞培養(yǎng)后，吸除培養(yǎng)基，冰上RIPA 按70 μL/well，PMSF 按RIPA 的1/100 加入，冰上裂解30 min。刮取裂解細胞于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，取上清為細胞總蛋白。BCA 法蛋白定量，于12%SDS-PAGE 行細胞蛋白電泳，轉于PVDF 膜上，剪取目的條帶，5%脫脂奶封閉3 h，分別孵LC3-II、p-Akt和p-mTORⅠ抗過夜，第2天孵HRP 標記Ⅱ抗1 h，暗室中加入發(fā)光液，黑白膠片曝光。所得到免疫印跡的定量可以用Bio-Rad提供的Molecular Analyst software進行灰度分析。計算LC3-II、p-Akt、p-mTOR和內(nèi)參照GAPDH比值，評價自噬形成及mTOR通路激活情況。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計量資料采用單因素方差分析或者Kruskal-Wallis檢驗；統(tǒng)計分析軟件使用SPSS 17.0。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 穩(wěn)定表達GFP-LC3的RAW264.7細胞系的建立

構建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表達載體，應用轉染技術將該質(zhì)粒導入RAW264.7細胞，用G418篩選穩(wěn)定表達的細胞系。真核細胞中GFP-LC3的表達用熒光顯微鏡檢測，如圖1所示，可見RAW264.7細胞穩(wěn)定表達GFP-LC3并在藍光照射下發(fā)出綠色熒光。

2 檢測各組巨噬細胞自噬情況

2.1用qRT-PCR方法檢測細胞自噬相關基因的mRNA表達水平 如圖2所示，在5組細胞中，自噬相關基因的表達存在明顯差異，在饑餓狀態(tài)下巨噬細胞均處于自噬激活狀態(tài)，自噬相關基因Atg5、Atg7、LC3-II和Bnip3的mRNA表達均上升；在LPS刺激下，巨噬細胞的自噬處于抑制狀態(tài)，與對照組比，Atg5、LC3-II和Bnip3存在顯著差異，但是Atg7的mRNA水平與對照組沒有明顯差異；加入PI3K抑制劑(hVps34)和mTOR抑制劑(雷帕霉素)后，巨噬細胞的自噬明顯處于激活狀態(tài)，與對照組相比，Atg5、 Atg7、LC3-II和Bnip3的mRNA表達均上升。

Figure 1. pcDNA3.1-GFP-LC3 transfected into RAW264.7 cells (×200).A:fluorescence; B: phase-contrast; C: merged.

Figure 2. The mRNA expression of Atg5, Atg7, LC3-II and Bnip3 in each group. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.2在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成 如圖3所示，將GFP-LC3融合蛋白轉入巨噬細胞后，在熒光顯微鏡下可以觀察自噬體的形成。單純巨噬細胞組中GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中，很少形成代表自噬體的熒光斑點；Earle’s平衡鹽溶液中巨噬細胞處于自噬激活狀態(tài)，可見自噬體形成；LPS組雖然有自噬體形成，單熒光強度低于Earle’s平衡鹽溶液組；另外2組均可看到較多自噬體的形成，LPS+雷帕霉素組最明顯。除了LPS組與對照組之間沒有明顯差異外，其它各組熒光強度與對照組之間存在明顯差異。

2.3利用Western blotting檢測LC3-II、p-Akt(Ser473)和p-mTOR(Ser2448)的變化 如圖4所示，p-Akt(Ser473)在Earle’s平衡鹽組、LPS組和LPS+雷帕霉素組中表達明顯升高；p-mTOR(Ser2448)在Earle’s平衡鹽組、LPS+hVps34組和LPS+雷帕霉素組表達明顯下降；LC3-II的表達在Earle’s平衡鹽組、LPS+hVps34組和LPS+雷帕霉素組中表達要高于對照組和LPS組。阻斷mTOR后，巨噬細胞自噬增強，這與文獻報道相同，mTOR對細胞自噬起到負調(diào)節(jié)作用。阻斷PI3K后，在LPS共同作用下，Akt磷酸化水平下降明顯，但是巨噬細胞自噬水平并沒有下降，這與文獻報道不符，應該存在其它相關通路對自噬進行調(diào)控。

討 論

在免疫網(wǎng)絡中巨噬細胞既是免疫效應細胞，又是免疫調(diào)節(jié)細胞[3-4]。(1)正相調(diào)節(jié)作用：體內(nèi)的巨噬細胞一般處于靜止狀態(tài)，當受到某些因素如病原體等異物或細胞因子等刺激后活化，活化的巨噬細胞功能明顯增強，不但吞噬各種病原體，殺傷腫瘤細胞，而且還向 T 細胞提呈抗原，分泌細胞因子參與免疫應答，該作用稱為免疫正相調(diào)節(jié)作用。(2)負相調(diào)節(jié)作用：巨噬細胞中還存在一種抑制性巨噬細胞，分泌多種可溶性抑制物如前列腺素、活性氧分子等抑制淋巴細胞增殖反應或直接損傷淋巴細胞，該作用稱為免疫負相調(diào)節(jié)作用。抑制性巨噬細胞經(jīng) LPS 刺激后發(fā)生免疫調(diào)節(jié)成為新型巨噬細胞，分泌 IL-1、IL-2、PGE 增加，能夠增強 T、B 淋巴細胞及 NK細胞活性，并保持或增強抗腫瘤效應[5]。(3)體內(nèi)各種因素通過調(diào)控巨噬細胞功能狀態(tài)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。多種神經(jīng)肽及激素樣物質(zhì)如 P 物質(zhì)、皮質(zhì)激素、性激素等均可通過相應受體而調(diào)控巨噬細胞的功能狀態(tài)；另外，某些神經(jīng)肽與細胞因子(如 IL-1、TNF-α、IFN-γ)可誘導巨噬細胞 MHC-Ⅱ類抗原的表達，從而調(diào)控其抗原呈遞功能[6]。

巨噬細胞是調(diào)控母體免疫狀況產(chǎn)生免疫耐受的重要細胞，從而決定胚胎是否可以免受免疫打擊而流產(chǎn)[7-9]。巨噬細胞是天然性免疫和獲得性免疫的橋梁，通過識別并耐受胚胎抗原直接影響妊娠結局，巨噬細胞的功能異常是導致母胎耐受異常、流產(chǎn)發(fā)生的重要原因[10-12]，研究已經(jīng)證明在流產(chǎn)的動物模型及臨床標本中巨噬細胞均處于活化狀態(tài)。因此明確巨噬細胞功能狀態(tài)對了解流產(chǎn)有重要意義。

Figure 4. Expression of LC3-II, p-Akt and p-mTOR tested by Western blotting.Lane 1: control group; Lane 2: starvation group; Lane 3: LPS group; Lane 4: LPS+PI3K inhibitor (hVps34) group; Lane 5: LPS+mTOR inhibitor (rapamycin) group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs LPS.

細胞自噬是溶酶體對自身結構的吞噬降解，它既是細胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)，也是是機體一種重要的防御和保護機制。巨噬細胞自噬狀態(tài)可以影響其具體功能。巨噬細胞可以通過自噬與溶酶體結合，消除、降解和消化受損、變性、衰老和失去功能的細胞、細胞器以及變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子。這種機能為細胞的重建、再生和修復提供必須原料，實現(xiàn)細胞內(nèi)資源的再循環(huán)和再利用。在生理狀態(tài)下，自噬作為機體的一種防御機制，在母體對胚胎免疫耐受的發(fā)病機制中具有十分重要作用。自噬在對中樞免疫耐受的誘導中起到關健作用。首先，自噬相關基因Atg5缺陷的胸腺移植可導致自身反應性CD4+T細胞的產(chǎn)生[13]；其次，自身免疫性腸病——克羅恩氏病的發(fā)生部分歸因于自噬相關基因Atg16L1的多態(tài)性[14]。然而，自噬在外周免疫耐受中的作用，目前尚無直接可用的實驗數(shù)據(jù)對其論證，但存在一些間接證據(jù)可以對其佐證。例如：來源于自噬相關基因Atg16L1缺陷的巨噬細胞經(jīng)內(nèi)毒素刺激后可產(chǎn)生更多的前炎癥細胞因子(IL-1β和IL-18)[15]。因此，自噬狀態(tài)關系到巨噬細胞的功能，在流產(chǎn)孕婦中間接關系到免疫狀態(tài)，從而對胎兒產(chǎn)生影響。

mTOR是調(diào)節(jié)細胞生長和增殖的重要因子，在與營養(yǎng)分子有關的信號轉導、蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控、細胞周期進展等過程中都占據(jù)重要地位；同時，它也是自噬啟動階段的關鍵調(diào)節(jié)因子，活化后可抑制自噬發(fā)生[16-17]。啟動階段的靶點主要為mTOR相關靶點，包括TOR 復合體1 (TOR complex 1， TORC1)和Ⅰ型PI3K。(1) TORC1：mTOR由2個獨立的復合體-TORC1和TORC2構成。細胞內(nèi)生長因子的信號及能量水平和營養(yǎng)狀態(tài)的信息會通過Ⅰ型PI3K和Akt/PKB通路傳遞給TORC1，并在達到適當?shù)乃綍r導致TORC1活化，從而激活mTOR，使自噬受到抑制。故而，可通過調(diào)節(jié)TORC1 的活性來影響mTOR的活性，進而調(diào)節(jié)細胞自噬的活性。最經(jīng)典的自噬相關藥物-雷帕霉素的作用靶點即為TORC1[18]。我們的實驗證實，加入雷帕霉素后巨噬細胞中的自噬明顯增強。(2) Ⅰ型PI3K：活化的生長因子受體可通過直接結合的方式來激活下游的Ⅰ型PI3K；也可通過生長因子受體結合蛋白2 (growth factor receptor-bound protein 2, GRB2)和SOS (Son of sevenless) 介導激活Ras，再由Ras間接激活Ⅰ型PI3K。但無論采用哪種方式, 激活Ⅰ型PI3K從而觸發(fā)mTOR通路是必不可少的環(huán)節(jié)，因而通過對Ⅰ型PI3K的調(diào)控就可起到對自噬進行調(diào)控的作用。我們加入經(jīng)典的自噬抑制藥物hVps34后，巨噬細胞的自噬并沒有明顯下降，這證明LPS對巨噬細胞的作用還存在其它的信號通路。LPS刺激巨噬細胞后，通過免疫熒光及Western blotting均可檢測到巨噬細胞的自噬有所增加，考慮是外界因素刺激巨噬細胞后，細胞本身產(chǎn)生的保護機制。而加入hVps34后，細胞內(nèi)自噬反而增加主要因為抑制了傳統(tǒng)自噬調(diào)控通路mTOR后，側枝通路調(diào)控加強所引起，同時協(xié)同LPS對細胞的Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)的激活，各方效果疊加后巨噬細胞的自噬反而增強。因此，LPS可以調(diào)控巨噬細胞的自噬，其可能的調(diào)控通路為PI3K/Akt/mTOR通路，但這不是唯一通路。

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