鄒 劍， 周后鳳， 先志偉， 劉培慶

(1成都市第五人民醫(yī)院藥劑科，四川 成都 611130; 2中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實驗室，廣東 廣州 510006)

左心室肥厚是原發(fā)性高血壓最常見的器官損傷性疾病，是心臟對壓力負荷和神經(jīng)體液因素改變的代償性反應(yīng)。心肌肥厚不僅僅是心力衰竭前期的一種適應(yīng)性反應(yīng)，也是心肌缺血、心律失常和猝死等心血管疾病的獨立危險因素[1]。導(dǎo)致病理性心肌肥厚的主要因素包括基因多態(tài)性、高血壓、缺血性損傷導(dǎo)致的心肌細胞死亡、心肌代謝改變等[2]。心肌肥厚和心力衰竭是眾多心血管疾病的嚴(yán)重和終末階段，研究其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制具有非常重要的意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體 α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)激動劑非諾貝特(fenofibrate)可通過多種信號途徑調(diào)控心肌肥大[3-4]。我們近期研究發(fā)現(xiàn)激活PPARα后可促進心肌細胞核內(nèi)PPARα與活化T細胞核因子胞漿型4(nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 4, NFATc4)之間的相互結(jié)合，抑制NFATc4與GATA 4之間的相互作用，進而抑制NFATc4在肥大基因腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)啟動子上的DNA結(jié)合活性，而沉默PPARα后可取消上述效應(yīng)[5]。鈣調(diào)磷酸酶/NFATc4信號通路是調(diào)控心肌肥大的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。NFATc4是病理性心肌肥大的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，過表達構(gòu)成性激活的NFATc4突變蛋白可誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生；而過表達顯性負突變的NFATc4蛋白可抑制內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)、苯腎上腺素(phenylephrine,PE)或血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細胞肥大[7]。近年來，炎癥反應(yīng)在心肌肥大中的作用受到廣泛關(guān)注。Kawano等[8]發(fā)現(xiàn)在ET-1、PE或AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大中，NF-κB的表達明顯上調(diào)，而抑制NF-κB能明顯減少肥大反應(yīng)。大量的研究結(jié)果證實，轉(zhuǎn)錄因子NFATc4和NF-κB在病理性心肌肥大的發(fā)病過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，它們在結(jié)構(gòu)中均有Rel同源結(jié)構(gòu)域(Rel homology domain，RHD)，這是蛋白質(zhì)之間相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此，我們推測兩者在心肌細胞內(nèi)可能存在相互作用，并有可能形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體參與對心肌肥大的調(diào)控。本文重點研究核受體PPARα與核轉(zhuǎn)錄因子NFATc4、NF-κB在心肌肥大中的相互作用及信號聯(lián)系，為進一步探索心肌肥大的發(fā)病機制和治療靶點提供新的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

抗小鼠PPARα的單克隆抗體(P0869)和非諾貝特(F6020)購自Sigma；NFATc4 (sc-13036)和p-NFATc4(sc-68710)抗體購自Santa Cruz；p65(ab7970-1)抗體購自Abcam；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce。

2 方法

2.1乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 取1～2 d SD乳鼠，用胰蛋白酶消化法(置冰上消化20 min后，37 ℃水浴中多次消化)將乳鼠左心室消化成單細胞懸液，在差速貼壁分離后，調(diào)節(jié)細胞密度至5×105/L接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并加入0.1 mmol/L BrdU抑制成纖維細胞生長。在培養(yǎng)48 h后更換為無血清培養(yǎng)基并加入試劑，用于后續(xù)實驗。

2.2Real-time PCR 按照Trizol說明書步驟提取細胞總RNA，利用紫外分光光度儀測定RNA濃度與純度。參照TaKaRa有限公司逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用兩步法進行PCR擴增，分別加入熒光染料、引物序列和逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后在real-time PCR儀中進行反應(yīng)。參數(shù)設(shè)置: 30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。引物由上海生工設(shè)計合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.3免疫共沉淀及Western blotting 按照Active Motif核蛋白抽提試劑盒說明書提取細胞核蛋白，將核蛋白(200 μg)與抗體或瓊脂糖珠混合置4 ℃，緩慢搖擺過夜。瓊脂糖珠經(jīng)緩沖液洗滌，提取蛋白進行Western blotting。SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于5% BSA封閉液中室溫封閉1 h后加入Ⅰ抗，孵育過夜。用TBST洗膜后加入Ⅱ抗并在室溫孵育1 h。加入ECL試劑，曝光，顯影，定影。

2.4電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA) 按照Pierce的EMSA試劑盒說明書，配制非變性PAGE膠，準(zhǔn)備核蛋白的結(jié)合反應(yīng)，依次加入Poly(dI:dC)、核蛋白和生物素標(biāo)記的探針，室溫放置20 min。4 ℃、100 V，電泳70～80 min，直至溴酚藍遷移到膠長的2/3 或3/4處，轉(zhuǎn)膜。將膜置于254 nm紫外燈下交聯(lián)10～15 min。每張膜加入10 mL封閉液，室溫封閉60 min，然后加入穩(wěn)定的鏈親和素-辣根過氧化物酶交聯(lián)物(SA-HRP)，曝光，顯影，定影。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 非諾貝特抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大

原代培養(yǎng)的心肌細胞先用非諾貝特(10 μmol/L)預(yù)處理1 h后，再加入100 nmol/L的AngⅡ處理24 h。AngⅡ刺激24 h后，肥大標(biāo)志物心房鈉尿因子(atrial natriuretic factor,ANF)、BNP和β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)mRNA水平升高，心肌細胞表面積也明顯增加。非諾貝特預(yù)處理能明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ANF、BNP和β-MHC mRNA水平增高，以及心肌細胞表面積的增加，見圖1。

Figure 1. Effects of fenofibrate (Feno) on the cardiomyocyte hypertrophy induced by AngⅡ. A: the mRNA levels of atrial natriuretic factor (ANF), brain natriuretic peptide (BNP) and β-myosin heavy chain (β-MHC) detected by real-time PCR; B: the cell surface area detected by rhodamine-phalloidin and DAPI staining (×500). Mean±SEM. n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs AngⅡ.

2 非諾貝特抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NFATc4與p65-NFκB的核轉(zhuǎn)位以及兩者之間的相互作用

如圖2A所示，AngⅡ(100 nmol/L)處理6 h后，NFATc4與p65-NFκB的入核明顯增加；而用非諾貝特預(yù)處理后能明顯抑制NFATc4與p65-NFκB的核轉(zhuǎn)位。如圖2B所示，AngⅡ(100 nmol/L) 刺激明顯增強心肌細胞核內(nèi)NFATc4與p65-NFκB之間的相互結(jié)合；而用非諾貝特預(yù)處理后，兩者之間的相互作用明顯減弱。這表明非諾貝特抑制轉(zhuǎn)錄因子NFATc4和p65-NFκB的轉(zhuǎn)位入核，以及兩者在心肌細胞核內(nèi)的相互作用，可能是其抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的重要機制。

Figure 2. The effects of fenofibrate (Feno) on the nuclear translocations (A) and interaction (B) of NFATc4 and p65 induced by AngⅡ. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs AngⅡ.

3 干預(yù)p65-NFκB對心肌細胞核內(nèi)NFATc4與PPARα或p65-NFκB相互作用的影響

如圖3A、B所示，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)能明顯增加心肌細胞核內(nèi)p65-NFκB的表達，而二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)可明顯減少心肌細胞核內(nèi)p65-NFκB的表達。PDTC能明顯抑制由AngⅡ引起的NFATc4與p65-NFκB間的相互作用，而TNF-α可取消非諾貝特對AngⅡ誘導(dǎo)的PPARα與NFATc4，以及NFATc4與p65-NFκB之間相互 作用的影響，見圖3C、D。

Figure 3. Effects of activation or inhibition of NF-κB on the interaction of NFATc4 with PPARα or p65-NFκB. The cardiomyocytes were treated with 0～20 μg/L TNF-α (A) or 0～100 μmol/L PDTC (B) for 6 h, and the nuclear protein expression of p65-NFκB was detected by Western blotting. Furthermore, the cardiomyocytes were pretreated with or without fenofibrate (Feno, 10 μmol/L), TNF-α (20 μg/L) and/or PDTC (100 μmol/L) for 1 h followed by AngⅡ (100 nmol/L) stimulation for 24 h, and the interactions of NFATc4 with PPARα (C) and NFATc4 with p65-NFκB (D) in the nucleus were determined by co-immunoprecipitation. *P<0.05,**P<0.01 vs control (no treatment); #P<0.05 vs AngⅡ alone; △P<0.05 vs co-treatment with AngⅡ and Feno.

4 非諾貝特對AngⅡ誘導(dǎo)的NFATc4在BNP啟動子上DNA結(jié)合活性的影響

研究表明，NFATc4可以直接結(jié)合在肥大相關(guān)基因的啟動子，調(diào)控肥大基因的表達[9]。我們在大鼠BNP啟動子上-330/-351區(qū)間發(fā)現(xiàn)有一個可疑的NFATc4的保守結(jié)合序列，我們依此設(shè)計了一條探針，并在3’端標(biāo)記了生物素。如圖4所示，AngⅡ可顯著增強NFATc4在BNP啟動子上的DNA結(jié)合活性；用非諾貝特或PDTC預(yù)處理1 h可明顯減弱AngⅡ誘導(dǎo)的NFATc4 DNA結(jié)合活性的增強;非諾貝特對AngⅡ誘導(dǎo)的NFATc4 DNA結(jié)合活性的抑制作用可被TNF-α所取消。

Figure 4. Effects of PPARα activation on NFATc4 binding to BNP promoter in the cardiomyocytes stimulated by AngⅡ. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs AngⅡ alone; △P<0.05 vs co-treatment with AngⅡand fenofibrate (Feno).

討 論

我們發(fā)現(xiàn)PPARα激動劑非諾貝特在體外能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大。給予非諾貝特后，心肌細胞核內(nèi)PPARα與NFATc4之間的相互作用明顯增強，同時伴隨著NFATc4與p65-NFκB之間相互作用的減弱，進而抑制了NFATc4在BNP啟動子上的DNA結(jié)合活性以及肥大標(biāo)志物的表達。此外，我們還發(fā)現(xiàn)非諾貝特的上述效應(yīng)可被對NF-κB具有較強激動作用的TNF-α取消。這些實驗結(jié)果有助于進一步理解非諾貝特抗心肌肥大作用的機制，并為通過干預(yù)轉(zhuǎn)錄因子相互作用從而防治心肌肥大提供了初步的實驗依據(jù)。

研究表明，NF-κB參與了病理性心肌肥大的分子調(diào)控[10-11]。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，主要存在于胞漿中。當(dāng)IκB被磷酸化降解后，NF-κB可快速入核并引起心肌肥大[8，12]。NFATc4和NF-κB在其結(jié)構(gòu)中均包含RHD同源結(jié)構(gòu)域，這是蛋白質(zhì)之間相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]。AngⅡ被廣泛用于體外心肌肥大的機制研究，AngⅡ刺激可以激活NFATc4和NF-κB信號通路[14-15]。我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ刺激能夠明顯增強NFATc4與p65-NFκB從胞漿向胞核的轉(zhuǎn)移，并增強心肌細胞核內(nèi)NFATc4與p65-NFκB的相互作用，同時伴隨著肥大標(biāo)志物ANF、BNP和β-MHC mRNA表達明顯上調(diào)。用非諾貝特預(yù)處理后可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NFATc4與p65-NFκB的核轉(zhuǎn)位和心肌細胞核內(nèi)NFATc4與p65-NFκB之間的相互作用，以及肥大標(biāo)志物的表達。這表明NFATc4與p65-NFκB之間的相互作用在心肌肥大的信號調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。

我們發(fā)現(xiàn)非諾貝特預(yù)處理可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NFATc4在BNP啟動子上的結(jié)合活性，并降低BNP mRNA和蛋白表達水平。為進一步證實PPARα對NFATc4轉(zhuǎn)錄活性的影響是否與NFATc4與p65-NFκB之間的相互作用有關(guān)，我們采用對NF-κB具有較強激動作用的TNF-α[13-14]和抑制劑PDTC[15]對心肌細胞進行預(yù)處理。Western blotting結(jié)果顯示，TNF-α明顯增加心肌細胞核內(nèi)p65-NFκB的蛋白表達，而PDTC則顯著抑制p65-NFκB在細胞核內(nèi)的表達。此外，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α明顯增強心肌細胞核內(nèi)NFATc4/p65-NFκB之間的相互作用，并減弱非諾貝特誘導(dǎo)的NFATc4/PPARα之間相互作用，逆轉(zhuǎn)非諾貝特對AngⅡ誘導(dǎo)的NFATc4轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用。而PDTC預(yù)處理后，可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NFATc4/p65-NFκB之間的相互作用以及NFATc4在BNP啟動子上DNA結(jié)合活性的增加。

綜上所述，在AngⅡ的作用下，NFATc4去磷酸化轉(zhuǎn)位入核，在細胞核內(nèi)NFATc4與p65-NFκB發(fā)生相互作用形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體并結(jié)合到靶基因BNP啟動子上，啟動BNP的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致心肌肥大的發(fā)生。非諾貝特預(yù)處理激活PPARα后，活化的PPARα進入細胞核內(nèi)并與NFATc4發(fā)生相互作用，這種相互作用可以抑制NFATc4/p65-NFκB轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成，阻止NFATc4結(jié)合到BNP啟動子序列上，抑制BNP的轉(zhuǎn)錄，進而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大。

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