楊璐晶，王 露，李文娟，李仁武，王曉燕，胡宏崗 (第二軍醫(yī)大學(xué),.研究生管理大隊(duì),.藥學(xué)院，上海 00433)

隨著人類(lèi)社會(huì)的發(fā)展與進(jìn)步，人口不斷增加，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，可供給人類(lèi)生存所必需的農(nóng)耕田逐年減少。因此，農(nóng)作物的產(chǎn)率就極大的引起了人們的關(guān)注，而真菌感染正是影響農(nóng)作物產(chǎn)率的一個(gè)重要因素。抗菌肽通常序列短，由微生物集體合成，是機(jī)體天然防御的一部分?？咕目梢缘钟婢肭?，對(duì)各種植物疾病有良好的作用[1]。因此，抗菌肽有可能成為一種新型農(nóng)藥用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)[2]。

近期研究表明，從變灰青霉中分離得到的直鏈四肽D-Phe-Val-D-Val-Tyr-OH有顯著的抗菌活性，該化合物對(duì)Fusariumvirguliforme(為大豆猝死綜合征病原菌)的MIC達(dá)9.5×10-3μmol/L，其抗真菌能力優(yōu)于市場(chǎng)上廣泛使用的抗菌藥物[3]，其化學(xué)合成方法尚未見(jiàn)報(bào)道。固相多肽合成是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種快捷高效的獲得多肽的方法。所以，本研究首次采用固相多肽合成，以2-氯三苯基氯樹(shù)脂為固相載體，首先將C端的酪氨酸與樹(shù)脂相連，再將其余3個(gè)氨基酸逐一與酪氨酸進(jìn)行連接，合成完畢后將四肽從樹(shù)脂上剪切下來(lái)，并脫去側(cè)鏈上的保護(hù)，獲得目標(biāo)多肽。

1 儀器與試劑

1.1儀器 恒溫磁力攪拌器(上海志威電器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(LOOYE ZX98-1), 水浴鍋(LOOYE ZX98-1) , 2ZX-4型旋片真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司) , 低溫冷卻循環(huán)泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司), 循環(huán)水式多用真空泵SHB-IIIA(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司), ZF7B三用紫外分析儀(上?？祷瘍x器制造廠)，Selecta固相合成儀。

1.2試劑 Fmoc-氨基酸(吉爾生化)、2-氯三苯基氯樹(shù)脂(CTC)、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-羥基苯并三氮唑( HOBt )、三氟乙酸( TFA)、N,N-二異丙基乙基胺( DIPEA )、三氟乙醇(TFE) 均購(gòu)自上海吉爾生化有限公司；茚三酮、哌啶、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷( DCM)、N-甲基吡咯烷酮( NMP )均為市售分析純?cè)噭灰译?色譜純，J&K)。

2 合成實(shí)驗(yàn)

2.1合成路線

圖1 D-Phe-Val-D-Val-Tyr-OH合成路線

a:DCM/DIPEA, 3 h; b(1) :HOBt/DMF/DCC/DCM, Fmoc-D-Val-OH, 30 min, b(2):HOBt/DMF/DCC/DCM, Fmoc-Val-OH, 30 min;

b(3):HOBt/DMF/DCC/DCM, Fmoc-D-Phe-OH, 30 min; c:TFE/AcOH/DCM(1:1:8),1 h; d:TFA/DCM(1:3),30 min

2.2Fmoc-酪氨酸與樹(shù)脂相連[4]取CTC樹(shù)脂1.0 g(取代度為1.08 mmol/g)加入到固相合成反應(yīng)管中，用DCM 30 ml浸泡30 min使CTC樹(shù)脂充分溶脹，活化待用。隨后加入Fmoc-Tyr(OtBu)-OH (749 mg，1.5 mmol)、二氯甲烷15 ml、DIPEA 0.42 ml，震蕩反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，將液體濾去，依次用甲醇、二氯甲烷洗滌樹(shù)脂各3次，抽干待用。

2.3氨基酸的逐步連接 在上步反應(yīng)樹(shù)脂中加入20%哌啶-DMF溶液15 ml，震蕩反應(yīng)30 min。將稱(chēng)量好的Fmoc-氨基酸(2 eq)與HOBt(3 eq)混溶于5 ml DMF溶液中，再加入DCC(3 eq)、二氯甲烷 15 ml，震蕩反應(yīng)30 min。并用20%哌啶-DMF溶液15 ml脫去Fmoc，然后將下一個(gè)Fmoc-氨基酸活化，將活化液過(guò)濾至固相反應(yīng)管中，震蕩反應(yīng)2 h，反應(yīng)完畢后用DMF、二氯甲烷各洗滌3次。根據(jù)多肽序列如此重復(fù)脫保護(hù)→縮合→脫保護(hù)，直到所有氨基酸連接完畢。

2.4四肽的游離和脫側(cè)鏈保護(hù) 本研究采用稀酸體系將多肽從樹(shù)脂上進(jìn)行游離。具體操作如下：在上步反應(yīng)樹(shù)脂中加入乙酸:三氟乙醇:二氯甲烷=1:1:8(V/V/V)30 ml，振蕩反應(yīng)1 h，過(guò)濾，樹(shù)脂再用二氯甲烷洗滌3次，濃縮濾液(期間加入甲苯除去殘留乙酸)得帶保護(hù)的多肽粗品409 mg。并且在粗品中加入TFA:DCM=1:3(V/V)20 ml，攪拌反應(yīng)30 min，濃縮得目標(biāo)多肽粗品，再用制備型高效液相進(jìn)行純化得純品267.5 mg，收率47.0%，純度大于95%。1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ 9.22～9.20 (m, 1H, NH), 8.46 (d, 1H,J=9.2 Hz, NH), 8.32 (d, 1H,J=8.4 Hz, NH), 8.13 (d, 1H,J=9.2 Hz, NH), 7.32～7.20 (m, 5H, Ar-H), 7.00(d, 2H,J=8.4 Hz，Ar-H), 6.63 (d, 2H,J=8.4 Hz, Ar-H), 4.56～4.53 (m, 1H, α-H), 4.39～4.34 (m, 1H, α-H), 4.34～4.31 (m, 1H, α-H), 4.56～4.53 (m, 1H, α-H), 4.26 (t, 1H,J=7.5 Hz), 3.06～3.02 (m, 1H), 2.96～2.90 (m, 2H), 2.70～2.65 (m, 1H), 1.86～1.74 (m, 2H), 0.68～0.62 (m, 9H, CH3), 0.54 (d, 3H,J=6.8 Hz, CH3)，m/zC28H39N4O6[M+ H]+: 527.36。

3 結(jié)果與討論

本研究通過(guò)4步反應(yīng)合成得到了目標(biāo)化合物D-Phe-Val-D-Val-Tyr-OH，終產(chǎn)物的合成收率為 47.0%。其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁和質(zhì)譜確證，合成方法簡(jiǎn)便易行，反應(yīng)條件溫和，收率高，合成得到的目標(biāo)化合物可用于抗真菌活性研究。

在用二氯甲烷洗滌樹(shù)脂過(guò)程中，遇到過(guò)抽濾速度瞬間減慢的情況，經(jīng)過(guò)分析可能原因是固相合成管在震蕩時(shí)發(fā)生堵塞。在濃縮濾液得粗品的過(guò)程中，蒸發(fā)得不帶固體粗品，經(jīng)過(guò)分析可能的原因?yàn)榇制啡芙庠谙∷狍w系中，所以加入甲苯降低其溶解度，并且得到了多肽粗品。

抗菌肽的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展，使農(nóng)作物產(chǎn)量有了進(jìn)一步提高的可能。但是，在抗菌肽廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)前，還需要驗(yàn)證和考慮很多問(wèn)題。如需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗菌肽的安全性，需要考慮真菌等微生物對(duì)抗菌肽的耐藥性等。所以，要想在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上真正使用抗菌肽還需要進(jìn)行很多研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Montesinos E, Bardaji E. Synthetic antimicrobial peptides as agricultural pesticides for plant disease control[J]. Chem Biodiver，2008, 5(7): 1225-1237.

[2] Chernysh S, Kim SI, Bekker G,etal. Antiviral and antitumor peptides from insects[J]. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(20):12628-12632.

[3] Bertinetti BV, Pea NI, Cabrera GM. An antifungal tetrapeptide from the culture ofpenicilliumcanescens[J]. Chem Biodiver，2009, 6(8): 1178- 1184.

[4] 胡春玲.鱉甲抗肝纖維化活性多肽的固相合成[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2011, 30(5):561-562.