張國慶，杜建紅，祝 輝，劉 徽，方 晨 (成都軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，四川 成都 610017)

稀苯扎溴銨溶液為2002年版《中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范》所收載的外用非滅菌溶液劑，具有消毒、防腐作用，用于皮膚消毒。由于2002年版《中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范》[2]未給出確切的微生物限度檢查方法，而2005年版之前的《中國藥典》對微生物限度檢查法也未規(guī)定對檢驗方法的適用性進行驗證，不能確保在該檢驗條件下的樣品濃度是否足以抑制污染微生物的生長，使供試品中污染的微生物得以真實的反映，從而保證結(jié)果的科學性與準確性。因此，依據(jù)《中國藥典》2010年版[1]二部的附錄XI J《微生物限度檢查法》中方法驗證試驗的要求，同時參照文獻[3～6]對本品建立微生物限度檢查方法并進行方法學驗證，確保方法的有效性。

1 儀器與材料

1.1儀器 BSC-1000IIA2生物安全柜(蘇州安泰空氣技術有限公司); SW-CJ-1FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司); LDZH高壓滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠); DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司); SHH 250 L生化培養(yǎng)箱(重慶四達試驗儀器有限公司); DKB8A電熱恒溫水浴箱(上海精宏實驗設備有限公司); HTY601集菌儀(杭州泰林生物技術設備有限公司); GDHD-4電熱恒溫鼓風干燥箱(廈門醫(yī)療電子儀器廠)。

1.2材料 稀苯扎溴銨溶液(批號:20130901, 20130902, 20130903，解放軍452醫(yī)院配制)。0.9%無菌氯化鈉溶液原料藥(成都市科龍化工試劑廠，批號：20120411)，后自行配制。0.9%無菌氯化鈉溶液(四川科倫藥業(yè)，批號：M13082302)。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(北京三藥科技開發(fā)公司，批號：1303112)，后按標簽說明進行配制。

1.3菌種 大腸桿菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]均來源于成都市食品藥品生物制品檢定所，均為第3代培養(yǎng)物。

1.4培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基( 111222);玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(1303262);營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(111207);改良馬丁培養(yǎng)基( 111214);改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(121122);膽鹽乳糖培養(yǎng)基(1203192);甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(120419);溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基(1109282);以上培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)，按標簽說明進行配制。

2 方法

2.1菌液制備 按《中國藥典》2010年版二部的附錄微生物限度檢查法進行制備。取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)24 h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU/ml的菌懸液，做活菌計數(shù)備用；取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)24 h的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU/ml的菌懸液，做活菌計數(shù)備用；取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，加5 ml生理鹽水洗下孢子，吸出孢子懸液(用管口帶有薄紗布的無菌毛細吸管吸出胞子懸液)至無菌試管中，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU/ml的孢子懸液，做活菌計數(shù)備用。

2.2供試液制備 取本品10 ml，加pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，即得1:10供試液。

2.3回收率測定

2.3.1供試品對照組 采用薄膜過濾法測定供試品本底細菌數(shù)。加入50 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾潤濕濾膜，取供試液10 ml加至50 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，混勻，過濾。用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜4次，每次100 ml。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)。

采用薄膜過濾法測定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)。方法同上，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)。

2.3.2菌液組 分別取上述大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種菌懸液1 ml，注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，測定所加的試驗菌數(shù)。

2.3.3試驗組 采用薄膜過濾法測定細菌數(shù)。采用“2.3.1”方法，在最后一次的沖洗液中分別加入大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌1 ml，混勻，過濾。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)72 h。每種菌制備2張濾膜。采用薄膜過濾法測定霉菌和酵母菌數(shù)。方法同上，在最后一次的沖洗液中分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌1 ml，混勻，過濾。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5 d(延至7 d)，每種菌制備2張濾膜。

2.3.4稀釋劑對照組 用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品。按試驗組的方法和條件沖洗，在最后一次的沖洗液中分別加入各陽性試驗菌1 ml，混勻，過濾，測定其菌數(shù)。

2.3.5結(jié)果 各驗證菌回收率測定結(jié)果見表1。

表2 微生物限度檢查(薄膜過濾法)各驗證菌的回收率(n=3)

2.4控制菌檢查方法的驗證

2.4.1供試液制備 同“2.2”。

2.4.2銅綠假單胞菌檢查方法的驗證(結(jié)果見表2)。

表2 銅綠假單胞菌檢查方法驗證結(jié)果

2.4.2.1供試品對照組 加入50 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾潤濕濾膜，取供試液10 ml加至50 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，過濾。用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜4次，每次100 ml。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，放入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，和陽性對照組比較，觀察是否有典型菌落生長。

2.4.2.2試驗組 方法同供試品對照組，在最后一次的沖洗液中加入銅綠假單胞菌懸液1 ml，混勻，過濾。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，放入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，和陽性對照組比較，觀察是否有典型菌落生長。

2.4.2.3陽性對照組 取制備好的銅綠假單胞菌菌懸液1 ml加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，觀察細菌生長情況。

2.4.2.4陰性對照組 取制備好的大腸桿菌菌懸液1 ml加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)22 h后，觀察細菌生長情況 。

2.4.3金黃色葡萄球菌檢查方法的驗證(結(jié)果見表3)。

表3 金黃色葡萄球菌檢查方法驗證結(jié)果

2.4.3.1供試品對照組 加入50 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾潤濕濾膜，取供試液10 ml加至50 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，混勻，過濾。用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜4次，每次100 ml。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，放入100 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，和陽性對照組比較，觀察是否有典型菌落生長。

2.4.3.2試驗組 方法同供試品對照組，在最后一次的沖洗液中加入金黃色葡萄球菌懸液1 ml，混勻，過濾。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，放入100 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，和陽性對照組比較，觀察是否有典型菌落生長。

2.4.3.3陽性對照組 取制備好的金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml加入100 ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，觀察細菌生長情況。

2.4.3.4陰性對照組 取制備好的大腸桿菌菌懸液1 ml加入100 ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，觀察細菌生長情況。

3 結(jié)果

3.1菌落計數(shù)驗證結(jié)果 由表1可知，本品采用薄膜過濾法對細菌的人工染菌回收率進行測定，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%；采用薄膜過濾法對霉菌和酵母菌數(shù)的人工染菌回收率進行測定, 白色念珠菌、黑曲霉的人工染菌回收率均高于70%，同時，稀釋劑對照組的人工染菌回收率均高于70%。因此，本品的細菌、霉菌和酵母菌數(shù)的計數(shù)均可采用薄膜過濾法進行測定(沖洗量：100 ml/次，沖洗4次)。

3.2控制菌檢查的驗證結(jié)果 由表2可知，供試品對照組未檢出銅綠假單胞菌，試驗組、陽性對照組均檢出銅綠假單胞菌，本品對銅綠假單胞菌的檢查采用薄膜過濾法(沖洗量：100 ml/次，沖洗4次)。

由表3可知，供試品對照組未檢出金黃色葡萄球菌，試驗組、陽性對照組均檢出金黃色葡萄球菌，本品對金黃色葡萄球菌的檢查采用薄膜過濾法(沖洗量：100 ml/次，沖洗4次)。

4 方法驗證結(jié)論及標準修訂

本品可采用薄膜過濾法進行細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)，另可采用薄膜過濾法進行控制菌的檢查。根據(jù)驗證結(jié)果將微生物限度檢查方法記錄如下:

微生物限度 取本品10 ml，加pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，得1:10供試液。細菌計數(shù)采用薄膜過濾法(沖洗量:100 ml/次，沖洗4次) ，霉菌和酵母菌計數(shù)采用薄膜過濾法(沖洗量：100 ml/次，沖洗4次)，控制菌采用薄膜過濾法進行檢查(培養(yǎng)基:100 ml;沖洗量:100 ml/次，沖洗4次)(中國藥典2010年版二部附錄Ⅺ J)，應符合規(guī)定。

5 討論與建議

5.1在選用微生物限度驗證方法時，有通用原則，即：“就簡不就繁”。而筆者不能直接判定稀苯扎溴銨溶液對細菌、霉菌和酵母菌以及控制菌的抑菌程度，所以在采用薄膜過濾法之前，還考察了常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法(0.1 ml/皿 )，由于采用此二法則供試品對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的人工染菌回收率低于70%。因此，本品細菌、霉菌及酵母菌的計數(shù)均應重新選擇適當?shù)姆椒ǎ湟志钚院笤龠M行驗證,并且控制菌也不能檢出。所以筆者選用薄膜過濾法。

5.2本品為2002年版《中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范》外用非滅菌溶液劑，可參照2010年版《中國藥典》中對洗劑或搽劑的檢查標準。由于在臨床上用于皮膚的消毒，因此建議微生物限度規(guī)定值比普通外用制劑的標準更加嚴格，可以規(guī)定為細菌數(shù)應不得過10 CFU/ml，霉菌和酵母菌數(shù)應不得過10 CFU/ ml，每1毫升不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

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