陳 穎，韓進(jìn)松，王重慶，宋云龍，周永剛，朱 駒 (.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，上海 00433; .解放軍8醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 000)

磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinases, PI3K)是脂激酶家族成員之一，其介導(dǎo)的信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活、凋亡和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，翻譯及血管生成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]。PI3K通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系。該通路已成為近年來(lái)廣泛研究的藥物靶點(diǎn)之一[2,3]，尤其在近幾年內(nèi)，許多PI3K小分子抑制劑進(jìn)入臨床研究，其中磷脂酰肌醇3激酶-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-mTOR)雙重抑制劑的研究成為該領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)之一。因此，本文就11 個(gè)PI3K-mTOR雙重抑制劑的構(gòu)效關(guān)系及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 PI3K的結(jié)構(gòu)和分類

PI3K是一類復(fù)雜的進(jìn)化保守的酶家族，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，PI3K根據(jù)其結(jié)構(gòu)和生物功能主要分為3型。I型是受體調(diào)控的4,5-二磷酸磷脂酰肌醇[PtdIns(4,5)P2]激酶，可分為IA和IB兩個(gè)亞型。IA亞型(PI3Kα, PI3Kβ和PI3Kδ)是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成的異質(zhì)二聚體。IB亞型即PI3Kγ,是由p110γ催化亞基和p101調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成的異質(zhì)二聚體[4]。IA和IB兩個(gè)亞型分別被受體酪氨酸激酶(RTKs)和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)激活。

II型PI3Ks的C端為C2區(qū)域，故稱其為PI3K-C2激酶，有3種亞型：PI3K-C2α、PI3K-C2β和 PI3K-C2γ，目前關(guān)于PI3K-C2s在體內(nèi)的催化底物還不是很明確，但有研究表明Ⅱ型PI3Ks可以生成3-磷酸磷脂酰肌醇[PtdIns(3)P]，也有可能生成3，4-二磷酸磷脂酰肌醇[PtdIns(3,4)P2][5，6]。Ⅲ型PI3Ks由具有催化性的酶Vps34(Vacuolar protein sorting-associated protein 34)和p150亞基構(gòu)成的異質(zhì)二聚體組成。雖然Vps34與p110α具有同源性，但是其只利用磷脂酰肌醇(PtdIns)作為底物，而非PtdIns(4,5)P2，即具有磷脂酰肌醇特異性的PI3K活性。此外，有些研究中將PI3K相關(guān)蛋白激酶PIKK(其中包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，mTOR)劃分為Ⅳ型PI3K[6]。目前，PI3K的小分子抑制劑的研究主要集中于Ⅰ型PI3K。

2 PI3K信號(hào)通路

PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路可以被多種途徑激活，包括酪氨酸激酶受體如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)，G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)。激活后的PI3K催化肌醇在D3位的磷酸化，磷酸化的產(chǎn)物3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇[PtdIns(3,4,5) P3, PIP3]在磷脂酰肌醇依賴性激酶(PDK-1)的作用下直接與蛋白激酶B(AKT)的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促進(jìn)AKT的Thr308的磷酸化，在AKT的活化中，Thr308的磷酸化十分關(guān)鍵，但8年后發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mTORC2)能使AKT的Ser473磷酸化，Thr308和Ser473的磷酸化是AKT活化的必要條件。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有100多種激活后的AKT底物，包括胰島素信號(hào)通路中的糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p21以及叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FKHR),同時(shí)也能磷酸化BAD，使BCL-2或BCL-XL 被釋放，恢復(fù)其抗凋亡功能，促進(jìn)細(xì)胞存活。其中mTOR是AKT的重要底物之一，具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶活性。AKT激活mTOR是通過(guò)直接磷酸化mTOR，或者使AKT磷酸化后形成的結(jié)節(jié)性復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex 2, TSC2)失活，達(dá)到mTOR的激活。mTORC1的下游效應(yīng)子主要是核糖體p70S6激酶蛋白(S6R1, Kibosomal p70S61 kinase)和翻譯抑制因子4EBP1，有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯和提高細(xì)胞增殖、存活及促血管生成的作用[7]。

3 PI3K的生物學(xué)作用

PI3K的小分子抑制劑的研究主要集中于I型PI3K，源于I型PI3K/AKT/mTOR通路在多種腫瘤中的失調(diào)。該通路通過(guò)PI3K的負(fù)調(diào)控因子蛋白磷酸酶(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome, PTEN)來(lái)調(diào)節(jié)和抑制PIP2向PIP3的轉(zhuǎn)化。在惡性腫瘤中，常見(jiàn)PTEN的缺失或突變[8]。這些變異使細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的依賴減小，細(xì)胞凋亡變慢，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。同時(shí)編碼p110α亞基

的基因PIK3CA過(guò)表達(dá)[9]。此外，幾乎所有的I型PI3K都可由于p85調(diào)節(jié)亞基的突變而被激活。因而，PI3K通路的抑制成為近年來(lái)腫瘤治療領(lǐng)域非常有前景的治療策略。

4 PI3K抑制劑的研究進(jìn)展

1957年,第一個(gè)PI3K抑制劑渥曼青霉素從真菌中提取出來(lái)，該化合物同時(shí)也顯示出對(duì)mTOR有一定的抑制作用。20世紀(jì)90年代Lilly合成了PI3K抑制劑LY294002(圖1，對(duì)于PI3Ks的IC503.8 μmol/L)。但由于其藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不佳、毒性大且選擇性差，限制了其被進(jìn)一步開發(fā)為臨床藥物。隨著近10年來(lái)相關(guān)研究的深入，多種類型的PI3K小分子抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)，包括I型廣譜PI3K抑制劑(可同時(shí)抑制下游mTOR)和亞型選擇性的PI3K抑制劑。最近研究已經(jīng)表明，與mTOR抑制劑相比，PI3K-mTOR的雙重抑制劑可以通過(guò)對(duì)該信號(hào)通路上的多個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行抑制，同時(shí)防止AKT介導(dǎo)的信號(hào)的增加，達(dá)到抗腫瘤效果增強(qiáng)的作用。另外，PI3K的p110亞基和mTOR的催化結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)相似性極大地推動(dòng)了該類雙重抑制劑的發(fā)展[3]。

圖1 LY294002化學(xué)結(jié)構(gòu)式

4.1GDC0980 GDC0980是具有噻吩[3,2-d]嘧啶骨架的嗎啉芳基衍生物(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2)。結(jié)構(gòu)與GDC0941很類似，用2-氨基嘧啶替代GDC0941(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2)結(jié)構(gòu)中的吲哚基團(tuán)后，GDC0980具有PI3K-mTOR雙重抑制活性(對(duì)于PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ的IC50值分別為5、27、7、14 nmol/L；對(duì)于mTOR, Ki 值為17 nmol/L)。

圖2 GDC0980和GDC0941化學(xué)結(jié)構(gòu)式

4.2XL765 該化合物(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3)對(duì)PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ的IC50值分別為39、113、43、9 nmol/L；對(duì)mTORC1和mTORC2的IC50值分別為190、908 nmol/L。目前對(duì)其構(gòu)效關(guān)系和結(jié)合模式的報(bào)道較少[11]。

圖3 XL765化學(xué)結(jié)構(gòu)式

4.3SF1126 在化合物L(fēng)Y294002的基礎(chǔ)上研究前藥，發(fā)現(xiàn)了化合物SF1126(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4)。由于LY294002的選擇性較低，可溶性較差，藥效較低，故將LY294002與血管靶向的四肽SF1174結(jié)合，用于抗癌治療。SF1126對(duì)于PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ以及mTOR的IC50值分別為356、736、3 225、1 774、1 060 nmol/L，能夠通過(guò)與特異性的整合素結(jié)合而聚集在腫瘤新生血管周圍，并選擇性在腫瘤組織中釋放LY294002[12]。LY294002的水溶性較差，半衰期較短，而SF1174水溶性好，并顯示出較好的藥代動(dòng)力學(xué)特性，且該化合物在多種動(dòng)物模型中具有較好的耐受性，對(duì)多種人類腫瘤具有較強(qiáng)的體內(nèi)抑瘤活性[13]。

圖4 SF1126化學(xué)結(jié)構(gòu)式

4.4BEZ235 該化合物是以咪唑并[4,5-c]喹啉酮為骨架的雙重抑制劑(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5)，對(duì)PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ以及mTOR的IC50值分別為4、75、 7、5、21 nmol/L，能有效抑制突變的PI3Kα。對(duì)于VEGFR、 c-Src、 PKA、AKT和PDK1等一系列蛋白激酶活性較差[14]。另外，BEZ235對(duì)惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(U87MG)和PC3M腫瘤異種移植有顯著的抑瘤活性。以咪唑喹啉為骨架的先導(dǎo)化合物通過(guò)以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的設(shè)計(jì)方法得到BEZ235，以期模仿與ATP的腺嘌呤部分的氫鍵結(jié)合[14]。利用同源模建PI3Kα來(lái)進(jìn)行對(duì)接研究，結(jié)果顯示，BEZ235與Val851、Asp933、Ser774之間存在復(fù)雜的氫鍵結(jié)合，與ATP結(jié)合位點(diǎn)的一些保守的疏水殘基之間存在范德華力。通過(guò)mTOR同源模建后進(jìn)行對(duì)接，發(fā)現(xiàn)BEZ235具有類似的結(jié)合模式[14]。

圖5 BEZ235化學(xué)結(jié)構(gòu)式

4.5PF04691502 該化合物具有優(yōu)秀的激酶選擇性，良好的ADMET性質(zhì)和體內(nèi)抗腫瘤活性，對(duì)于PI3Kα和mTOR的Ki值分別為0.57和16 nmol/L(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6)。該化合物通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)方法從一系列4-甲基吡啶嘧啶酮類(MPPs)化合物中得到。在這系列MPPs中，PF00271897(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6)因其對(duì)PI3Kα的Ki值為1.4 nmol/L，對(duì)mTOR的Ki值為840 nmol/L，以及其較高的配體效率(LE=0.48)而被作為進(jìn)一步物理性質(zhì)優(yōu)化篩選的候選化合物。這兩個(gè)化合物與PI3Kγ的共晶結(jié)構(gòu)顯示，兩個(gè)化合物的氨基嘧啶部分都能與PI3Kγ鉸鏈區(qū)的Val882殘基形成氫鍵結(jié)合。在晶體復(fù)合物中，PF04691502結(jié)構(gòu)中嘧啶環(huán)的氮原子與一個(gè)結(jié)合水分子能在親水口袋形成水橋，而在PF00271897-PI3Kγ復(fù)合物中，苯甲醇基團(tuán)占據(jù)了該位點(diǎn)。同時(shí)，這兩個(gè)化合物的母環(huán)吡啶嘧啶酮結(jié)構(gòu)能在鉸鏈區(qū)形成疏水口袋。該口袋特異性地存在于PI3Ks和mTOR,與化合物存在激酶選擇性有關(guān)[10]。

4.6GSK2126458 葛蘭素史克公司在化合物GSK1059615的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，利用基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)方法得到GSK2126458，其具有高活性、高選擇性和良好的藥動(dòng)學(xué)特性(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7)[15]。該化合物最初的設(shè)計(jì)策略是將GSK1059615(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7)中的噻唑烷二酮結(jié)構(gòu)替換為更大的片段以便更緊密結(jié)合于酶口袋。后續(xù)的結(jié)構(gòu)修飾將著眼于提高化合物的水溶性，改善藥代動(dòng)力學(xué)特性。通過(guò)對(duì)該化合物與PI3Kγ的共晶結(jié)構(gòu)分析，可知化合物在生理pH條件下，結(jié)構(gòu)中的磺酰胺的-NH部分與Lys833形成靜電作用，這有可能解釋了其活性普遍優(yōu)于已報(bào)道的PI3K抑制劑的原因。此外，化合物結(jié)構(gòu)中吡啶環(huán)的氮原子通過(guò)水分子的橋連作用形成氫鍵，喹啉環(huán)的氮原子與Val882形成氫鍵，二氟苯基基團(tuán)在Asp964附近填充疏水區(qū)域(其與PI3Kγ的結(jié)合模式見(jiàn)圖8[15])。

圖6 PF00271897和PF04691502化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖7 GSK1059615和GSK2126458化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖8 GSK2126458與PI3Kγ的結(jié)合模式

該化合物對(duì)于常見(jiàn)的突變型PI3Kα顯示皮摩爾(pmol)級(jí)活性(對(duì)于PI3Kα的Glu542、Glu545和His1047突變型的Ki值分別為0.008、0.008、0.009 nmol/L)，對(duì)mTOR(對(duì)mTORC1和mTORC2的Ki值分別為0.18、0.30 nmol/L)之外的蛋白激酶有很高的選擇性。該化合物不僅酶活性高，細(xì)胞活性也很強(qiáng)，同時(shí)體內(nèi)抗腫瘤活性優(yōu)異。

4.7PKI587 該化合物是近來(lái)出現(xiàn)的另一個(gè)PI3K-mTOR雙重抑制劑(對(duì)PI3Kα、PI3Kγ、mTOR的IC50值分別為0.4、5.4、1.6 nmol/L)(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖9)[16]。與先前報(bào)道的以三唑并嘧啶為骨架的化合物PKI402 (結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖9) (對(duì)PI3Kα、PI3Kγ、mTOR的IC50值分別為1.4、9.2、1.7 nmol/L)結(jié)構(gòu)相似性很高，將母核中的嘧啶環(huán)替換為1,3,5-三嗪，來(lái)提高PKI587的溶解度。在化合物中引入兩個(gè)嗎啉基團(tuán)的目的是即使其中一個(gè)嗎啉環(huán)在體內(nèi)發(fā)生氧化代謝，還有另一個(gè)能與鉸鏈區(qū)的纈氨酸殘基發(fā)生氫鍵相互作用[16，17]。PKI587對(duì)于乳腺癌，結(jié)腸癌，肺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的異體移植模型具有顯著抗癌活性[18]。

4.8BGT226 該化合物與BEZ235具有相同的咪唑并[4,5-c]喹啉酮骨架(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖10)。BGT226能抑制乳腺癌細(xì)胞和經(jīng)放療后的腫瘤細(xì)胞中的Akt和S6的磷酸化。實(shí)驗(yàn)表明，該化合物對(duì)于若干腫瘤細(xì)胞株顯示出納摩爾級(jí)的活性。BGT226在臨床一期劑量遞增研究中，顯示出快速吸收，且半衰期在6～9 h[19, 20]。

圖9 PKI587和PKI402化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖10 BGT226化學(xué)結(jié)構(gòu)式

4.9GNE477 研究人員在對(duì)噻吩嘧啶類衍生物GDC0941進(jìn)行一系列結(jié)構(gòu)修飾時(shí)，發(fā)現(xiàn)雙重抑制劑GNE477(對(duì)PI3Kα的IC50值為2 nmol/L，對(duì)mTOR的Ki值為29 nmol/L)，對(duì)腫瘤細(xì)胞PC3的活性優(yōu)良，藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)理想(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖11)。構(gòu)效關(guān)系研究表明，GDC0941結(jié)構(gòu)中的吲哚基團(tuán)被2-氨基嘧啶替換后活性保持(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖11中化合物1)，對(duì)PI3Kα的IC50值為3 nmol/L)，該化合物同時(shí)顯示出對(duì)mTOR的抑制活性(Ki值為29 nmol/L)。在噻吩嘧啶母環(huán)的6位無(wú)取代時(shí)，化合物2 (結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖11)同樣顯示出對(duì)PI3K-mTOR的雙重抑制活性(對(duì)PI3Kα的IC50值為5 nmol/L，對(duì)mTOR的Ki值為42 nmol/L)，由此可知，活性的保持主要是由于嗎啉取代的噻吩嘧啶部分的存在?；衔颎NE477在化合物1母環(huán)7位引入甲基以達(dá)到打破平面結(jié)構(gòu)降低熔點(diǎn)以及提高口服生物利用度的目的[21]。

圖11 GNE477及化合物1、2化學(xué)結(jié)構(gòu)式

4.10PWT33597和DS7423 化合物PWT33597在體外顯示出高度的選擇性，同時(shí)對(duì)于腫瘤組織分布較好，通路抑制有效，在多種遺傳背景的異體移植腫瘤模型中顯示優(yōu)良的口服有效性。該化合物藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)良好，正在進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗(yàn)。化合物DS7423目前也在進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗(yàn)[22]。

5 總結(jié)

筆者綜述了近年來(lái)進(jìn)入臨床研究的PI3K-mTOR雙重小分子抑制劑。該通路上的關(guān)鍵靶酶已成為抗腫瘤治療領(lǐng)域很有前景的藥物靶點(diǎn)，對(duì)于藥物化學(xué)工作者來(lái)說(shuō)，既是機(jī)遇，也是挑戰(zhàn)，如何開發(fā)出高活性、藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)良好的PI3K-mTOR小分子抑制劑，并正確使用于臨床，將有許多難題需要克服。如目前出現(xiàn)的耐藥問(wèn)題以及臨床上的聯(lián)合用藥方案都有待進(jìn)一步研究。

自2006年隨著小分子抑制劑BEZ235進(jìn)入臨床研究，接下來(lái)的六七年中，10多個(gè)很有治療前景的雙重PI3K-mTOR小分子抑制劑陸續(xù)進(jìn)入不同階段的臨床研究。這些研究也揭示了該靶點(diǎn)的一些普遍特征。例如通過(guò)對(duì)一系列文獻(xiàn)報(bào)道的化合物分子的晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的分析，筆者發(fā)現(xiàn)很多結(jié)構(gòu)類型小分子與鉸鏈區(qū)的纈氨酸殘基存在氫鍵作用，與親水口袋的賴氨酸與天冬氨酸殘基形成氫鍵。這些締合上的特點(diǎn)，為深入研究新型高效、高選擇性的PI3K-mTOR雙重小分子抑制劑提供了有效的研究指導(dǎo)。

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