葛淑芳，章 藝，吳玉環(huán)，徐根娣，劉 鵬

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2.浙江旅游職業(yè)學(xué)院，浙江 杭州311231;3.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 330036)

銅是植物生長(zhǎng)所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，廣泛參與植株的各種生命活動(dòng).但是當(dāng)細(xì)胞中銅濃度超過一定范圍時(shí)，就會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用［1］.近年來(lái)在農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域均有含銅污染物的大量排放，如含銅殺蟲劑的過度使用、工廠生產(chǎn)中含銅污染物的大量排出及銅礦的超標(biāo)開采等等，導(dǎo)致不少地區(qū)土壤中的銅含量已超出植物可正常利用的范圍［2-4］.銅含量過高會(huì)導(dǎo)致煙草的生長(zhǎng)發(fā)育、抗氧化系統(tǒng)等受到抑制甚至毒害作用，進(jìn)而會(huì)影響煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量，而煙草品質(zhì)的好壞通過煙草產(chǎn)品直接影響著人類的健康［5］.煙草作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，除制作烤煙外，煙草在食品和藥物資源方面的潛力也越來(lái)越多地被開發(fā)和利用，如:煙葉富含蛋白質(zhì)，再生能力強(qiáng)，一年可多次收獲，因而從鮮煙葉中提取蛋白，其產(chǎn)量明顯超過從大豆中獲得的蛋白;從煙葉中提取的煙堿是醫(yī)藥中常用的一種藥劑;煙草是著名的模式作物，也是生物技術(shù)中常用的生物反應(yīng)器，是抗癌、抗艾滋病等關(guān)系到人類健康基因表達(dá)的理想場(chǎng)所［6］.由此可見，煙草具有很高的綜合開發(fā)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是目前有關(guān)煙草遭受銅污染的深入研究卻鮮見報(bào)道.本文通過水培法研究了銅污染對(duì)煙草生長(zhǎng)及生理特性的影響，以期為進(jìn)一步探討銅污染下煙草的耐性機(jī)制提供一定的理論支持.

1 材料與方法

1.1 供試材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以耐銅性較強(qiáng)的煙草W38(Nicotiana tabacum L.var.W38)和耐銅性較弱的本氏煙(Nicotiana tabacum L.var.Benthamiana)為對(duì)比實(shí)驗(yàn)材料.

先將煙草種子經(jīng)10%的H2O2溶液表面消毒20 min，然后在25℃下黑暗浸種24 h，之后播種到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，等種子發(fā)芽后移植到沙子中，待幼苗的第4片真葉展開后，選取長(zhǎng)勢(shì)較為一致的幼苗移入到Hoagland 1/2完全營(yíng)養(yǎng)液中，預(yù)培養(yǎng)3 d后再轉(zhuǎn)入完全營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)6 d，然后按以下處理繼續(xù)培養(yǎng):T0(Cu2+0.0 mg/L，即對(duì)照組);T1(Cu2+0.5 mg/L);T2(Cu2+1.0 mg/L);T3(Cu2+2.0 mg/L);T4(Cu2+4.0 mg/L);T5(Cu2+8.0 mg/L).其中，Cu2+以 CuSO4·5H2O 的形式提供.每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液.處理15 d后取樣進(jìn)行相應(yīng)的生理指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù).實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)所用濃度是前期大量預(yù)試驗(yàn)所得.

1.2 測(cè)定指標(biāo)和方法

株高、根系長(zhǎng)度用直尺直接測(cè)量;植株鮮質(zhì)量用電子天平稱量.根系活力采用氯化三苯四氮唑(TTC)法測(cè)定［7］;相對(duì)質(zhì)膜透性用電導(dǎo)儀測(cè)定［8］.過氧化氫酶(CAT)活性參照Monnet等［9］的方法測(cè)定;超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性參照文獻(xiàn)［10］的方法測(cè)定;游離脯氨酸(Pro)含量測(cè)定參照張殿忠等［11］的茚三酮顯色法;丙二醛(MDA)含量采用巴比妥酸顯色法［12］.

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)定均設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差.數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0軟件中的Duncan法進(jìn)行顯著性差異分析，用Excel 2007軟件和Origin 8.0軟件制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度銅處理對(duì)煙草生長(zhǎng)特性的影響

從表1可以看出:在銅質(zhì)量濃度低于1.0 mg/L時(shí)，煙草W38和本氏煙的根長(zhǎng)、株高和鮮質(zhì)量均隨著銅濃度的增加而增加，說明低濃度的銅處理對(duì)煙草生長(zhǎng)有促進(jìn)作用;當(dāng)銅濃度高于1.0 mg/L時(shí)，這些參數(shù)值均隨著銅濃度的增加而顯著性降低(P＜0.05);當(dāng)銅濃度為4.0 mg/L時(shí)，本氏煙開始出現(xiàn)輕度傷害癥狀，葉片輕微失綠，質(zhì)量下降，而煙草W38未表現(xiàn)出抑制癥狀;當(dāng)銅濃度為8.0 mg/L時(shí)，本氏煙受到重度傷害，表現(xiàn)為煙株葉片發(fā)黃，嚴(yán)重者出現(xiàn)枯萎癥狀，且質(zhì)量降低為對(duì)照的54.49%，而煙草W38出現(xiàn)了中度傷害癥狀，植株矮小.由此說明了2個(gè)品種煙草的耐銅性差異.煙草W38生物量的增加值總體上高于本氏煙，但是株高相對(duì)低于本氏煙，這可能是植株形態(tài)差異性造成的.

表1 不同濃度銅處理對(duì)煙草幼苗生長(zhǎng)特性的影響

2.2 不同濃度銅處理對(duì)煙草根系活力及質(zhì)膜透性的影響

根系活力大小反映了根系代謝能力的強(qiáng)弱，直接影響植株的生長(zhǎng)和抗逆性.氯化三苯基四氮唑還原力反映了細(xì)胞內(nèi)總脫氫酶的活性，是反映植物體代謝活動(dòng)的一個(gè)重要指標(biāo).由表2可知:當(dāng)銅處理濃度為0.5 mg/L時(shí)，2個(gè)品種煙草的根系活力均達(dá)到最大峰值，煙草W38的根系活力大于本氏煙;當(dāng)銅濃度大于1.0 mg/L時(shí)，2個(gè)品種煙草的根系活力隨著銅濃度的增加而顯著性降低;在銅濃度為2.0 mg/L時(shí)，煙草W38與本氏煙根系活力與對(duì)照相比分別下降了1.56%和13.41%，可見銅敏感型的本氏煙受到的抑制程度更大.

植物細(xì)胞外滲液的電導(dǎo)率可作為植物細(xì)胞膜透性變化和損傷的標(biāo)志.由表2可知:當(dāng)銅處理濃度小于0.5 mg/L時(shí)，2個(gè)品種煙草的根系細(xì)胞膜透性隨著銅處理濃度的升高而下降;當(dāng)銅處理濃度大于1.0 mg/L時(shí)，細(xì)胞膜透性則隨著銅處理濃度的升高而上升.在銅處理下，本氏煙的根系細(xì)胞膜透性明顯高于煙草W38.當(dāng)銅濃度為4.0 mg/L時(shí)，煙草W38的根系細(xì)胞膜透性與銅濃度為2.0 mg/L時(shí)無(wú)顯著性差異，但本氏煙卻有顯著性差異，這些進(jìn)一步說明了本氏煙的抗逆性較弱.

表2 不同濃度銅處理對(duì)煙草根系活力及質(zhì)膜透性的影響

2.3 不同濃度銅處理對(duì)煙草抗氧化酶活性的影響

由圖1，圖2和圖3可以發(fā)現(xiàn)，隨著銅處理濃度的增高，2個(gè)品種煙草根系中的 CAT，SOD和POD的活性都隨著銅濃度的增高呈先增后降的變化趨勢(shì).

CAT主要存在于植物過氧化物酶體和乙醛酸循環(huán)體中，是清除H2O2的主要酶類，其主要作用是清除光呼吸所產(chǎn)生的H2.圖 1 表明:在銅濃度小于0.5 mg/L時(shí)，2個(gè)品種煙草的CAT活性隨著銅濃度的增加而升高，但與對(duì)照相比，本氏煙差異不顯著;當(dāng)銅濃度大于1.0 mg/L時(shí)，2個(gè)品種煙草的CAT活性隨著銅濃度的增加而降低，其中煙草W38的CAT活性與低濃度銅處理時(shí)的無(wú)顯著性差異，但本氏煙的CAT活性顯著性下降;當(dāng)銅處理濃度增加到2.0 mg/L和4.0 mg/L時(shí)，煙草W38的CAT活性無(wú)顯著性變化，本氏煙的CAT活性顯著降低.這說明煙草W38本身具有較高的活性氧自由基清除能力，表現(xiàn)出耐銅性，而本氏煙清除活性氧的能力有限.

作為植物的第一道防線［14］，SOD能清除細(xì)胞內(nèi)多余的超氧自由基，防止膜脂過氧化作用.由圖2可知，SOD活性的變化趨勢(shì)與CAT活性一致，說明了2個(gè)品種煙草耐銅性的差異.

POD是植物體內(nèi)有毒物質(zhì)的清除劑，在重金屬脅迫下，POD在提高植物耐脅迫性方面有重要的作用.由圖3可知，煙草W38和本氏煙的POD活性變化趨勢(shì)一致.當(dāng)銅濃度小于1.0 mg/L時(shí)，2個(gè)品種煙草的POD活性相對(duì)于對(duì)照組均有所增強(qiáng)，銅濃度為0.5 mg/L時(shí)POD活性最強(qiáng);當(dāng)銅的處理濃度大于1.0 mg/L時(shí)，POD活性均隨著銅濃度的升高而降低;當(dāng)銅濃度為8.0 mg/L時(shí)，2個(gè)品種煙草的POD活性都受到強(qiáng)烈的抑制，甚至影響了植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育.

圖1 不同濃度銅處理對(duì)煙草CAT活性的影響

圖2 不同濃度銅處理對(duì)煙草SOD活性的影響

圖4 不同濃度銅處理對(duì)煙草Pro含量的影響

2.4 不同濃度銅處理對(duì)煙草Pro含量的影響

由圖4可知，2個(gè)品種煙草的Pro含量隨著銅濃度的增加而增加.其中，煙草W38的Pro含量在銅脅迫下差異不顯著，而本氏煙在銅濃度為8.0 mg/L時(shí)Pro含量與低濃度銅處理時(shí)相比有顯著性變化.這可能是由于高強(qiáng)度的銅脅迫對(duì)銅敏感型的本氏煙產(chǎn)生了毒害作用.

圖3 不同濃度銅處理對(duì)煙草POD活性的影響

圖5 不同濃度銅處理對(duì)煙草MDA含量的影響

2.5 不同濃度銅處理對(duì)煙草MDA含量的影響

MDA是植物體內(nèi)膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量變化可以反映出植物細(xì)胞受損傷的程度.從圖5可知，隨著銅濃度的增加，煙草W38和本氏煙體內(nèi)的MDA含量均呈現(xiàn)先增加、后降低的趨勢(shì).過高的MDA含量是植物受到氧化損傷的一個(gè)信號(hào).在銅濃度為4.0 mg/L時(shí)，2個(gè)品種煙草的MDA含量均達(dá)到最大值，是對(duì)照的3倍多，且與對(duì)照組相比達(dá)到顯著性差異，說明該濃度的銅處理對(duì)煙草脅迫程度較大.但是，在濃度為8.0 mg/L銅處理下，2個(gè)品種煙草的MDA含量相對(duì)于4.0 mg/L銅脅迫下卻有所降低，且差異顯著，這可能是因?yàn)楦邼舛茹~處理導(dǎo)致煙株的細(xì)胞內(nèi)積累了大量的活性氧，最終使其失去了正常的生理代謝功能.

3 討論與結(jié)論

銅可以影響細(xì)胞質(zhì)的生理代謝，干擾細(xì)胞有絲分裂的能量供給，故有絲分裂中會(huì)出現(xiàn)分裂數(shù)目變少、分裂速度變慢的現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致植株的代謝紊亂、發(fā)育受阻，嚴(yán)重時(shí)則會(huì)發(fā)生植株死亡［15］.本研究發(fā)現(xiàn)，煙草植株生長(zhǎng)在低濃度(0.5 mg/L，1.0 mg/L)銅處理時(shí)與對(duì)照相比生長(zhǎng)發(fā)育狀況良好，其根長(zhǎng)、株高及單株鮮質(zhì)量均與對(duì)照相比呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且差異顯著.但是，當(dāng)銅濃度進(jìn)一步增加后，上述指標(biāo)則呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì).當(dāng)銅濃度為2.0，4.0 mg/L 時(shí)，植株外傷癥狀不明顯，但其生長(zhǎng)受到抑制;當(dāng)銅濃度加大為8.0 mg/L時(shí)，2個(gè)品種的煙草均出現(xiàn)嚴(yán)重的外傷癥狀，葉片發(fā)黃，須根呈深褐色.這與韋美玉等［16］發(fā)現(xiàn)低濃度CuSO4處理對(duì)芹菜生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，隨銅濃度遞增則對(duì)芹菜生長(zhǎng)有抑制作用的研究結(jié)果是一致的.

根系是植物最早感受到土壤逆境脅迫信號(hào)的器官，植物接收到逆境信號(hào)后會(huì)作出相應(yīng)的調(diào)整以適應(yīng)逆境.研究發(fā)現(xiàn)，植物根系活力大小與其抗逆境能力呈正相關(guān)關(guān)系，根系活力大則植物的抗逆境能力強(qiáng)，反之則弱［17］.本研究中，在既定處理時(shí)間內(nèi)，煙草的根系活力隨著銅處理濃度的升高而呈現(xiàn)先顯著增大、再降低的趨勢(shì)，這與劉鵬等［18］對(duì)煙草的研究結(jié)果一致.細(xì)胞質(zhì)膜是細(xì)胞與環(huán)境之間的界面與屏障，逆境脅迫下活性氧自由基會(huì)在植物體內(nèi)大量產(chǎn)生并積累，導(dǎo)致膜脂中的不飽和脂肪酸出現(xiàn)過氧化，進(jìn)而破壞生物膜的正常生理功能并致使質(zhì)膜損傷與電解質(zhì)異常流出［19］.植物細(xì)胞原生質(zhì)膜的完整性和穩(wěn)定性在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中扮演著非常重要的角色.植物細(xì)胞外滲液的電導(dǎo)率與所受污染物的濃度成正相關(guān)關(guān)系，由此可將細(xì)胞膜透性大小作為植物抵抗逆境的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一［20］.本實(shí)驗(yàn)中，隨著銅處理濃度的不斷升高，煙草根系細(xì)胞膜透性呈現(xiàn)出先降低、后升高的趨勢(shì)，說明低濃度銅處理增強(qiáng)了煙草生物膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，而高濃度銅處理嚴(yán)重破壞了細(xì)胞膜的完整性.這可能是因?yàn)檫^量的銅致使細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到破壞，大量銅滲入到細(xì)胞內(nèi)并與細(xì)胞膜蛋白的—SH或磷脂分子層的磷脂類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而改變了膜蛋白的磷脂結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的透性增大.

植物受到逆境脅迫時(shí)會(huì)造成體內(nèi)自由基的過量積累，從而損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而致使細(xì)胞生理生化代謝的紊亂.然而，植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的一系列抗氧化酶可以應(yīng)對(duì)活性氧的大量積累，其中不同的酶在植物抵抗逆境脅迫中有著各自不同的功能［21］.本實(shí)驗(yàn)中，2個(gè)品種煙草的 POD，SOD和CAT的活性隨著銅濃度的增加呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢(shì)，表明高濃度的銅會(huì)抑制煙草的POD，SOD和CAT的活性，從而造成3種保護(hù)酶的活性比例失調(diào)，故植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致煙草的生理代謝紊亂，加速了煙株各組織、器官的衰老.這與涂俊芳等［22］關(guān)于銅對(duì)紫背萍和青萍色素含量及抗氧化酶系統(tǒng)影響的報(bào)道結(jié)果一致，也和袁霞等［23］研究銅對(duì)小青菜葉片保護(hù)酶活性影響的結(jié)果相一致.

游離脯氨酸(Pro)作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物遭受脅迫誘導(dǎo)時(shí)會(huì)改變自身正常的代謝路徑，導(dǎo)致體內(nèi)Pro的氧化受阻，進(jìn)而使其含量升高，而Pro含量的升高可以降低水勢(shì)以維持植物體內(nèi)環(huán)境中的水分平衡，從而保證了植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育.本研究中，煙草根系Pro的含量隨著銅處理濃度的增大而增加，可能是由于當(dāng)煙草受到銅脅迫時(shí)，外界的脅迫越大，植株自身則需要更多的Pro來(lái)應(yīng)對(duì)以維持其生長(zhǎng).這與俞慧娜等［24］的研究結(jié)果是一致的.有研究指出，抗逆性越強(qiáng)的植物品種中游離Pro的含量也越高［25］.本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，抗銅性大的煙草品種W38的游離脯氨酸含量相對(duì)高于銅敏感型的本氏煙.

植物體內(nèi)MDA含量的多少可以較客觀地反映出植物細(xì)胞膜過氧化的程度和抵抗逆境能力的強(qiáng)弱［26］.本研究中，盡管銅污染處理時(shí)保護(hù)性酶的活性增強(qiáng)，但是這并不能完全清除銅脅迫產(chǎn)生的氧自由基，這從脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量隨著銅處理濃度的提高而上升的趨勢(shì)就可以得知，說明銅處理增加了植物體內(nèi)的膜質(zhì)過氧化水平.

本研究結(jié)果顯示，銅對(duì)煙草的生長(zhǎng)存在著劑量效應(yīng).當(dāng)銅處理濃度低于1.0 mg/L時(shí)，能在一定程度上促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育，從而可用于改善煙草的品質(zhì).但是，較高濃度的銅處理(大于1.0 mg/L)對(duì)煙草表現(xiàn)出抑制作用.

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