吳云華，鄧 歡

(中南民族大學 生命科學學院， 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室， 武漢 430074)

一氧化氮(NO)是一類可擴散的脂溶性小分子物質(zhì)，廣泛存在于生物體內(nèi)，易于在細胞內(nèi)和細胞間擴散[1].NO在植物體內(nèi)可自身合成，或通過酶促和非酶促反應進行[2].它作為植物體中的信使分子對植物的光形態(tài)建成[3]、呼吸作用和根的生長發(fā)育[4]起重要的作用，同時對植物進行各種生物脅迫[5](如病蟲害)和非生物脅迫[6](如干旱、鹽脅迫、低溫及重金屬)的信息傳遞中也發(fā)揮了重要作用.但目前關(guān)于NO在各種生理條件下對水稻幼苗影響的研究較少，尖鐮胞菌CYP55A1是一類具有NO還原作用的酶系，故也被稱為一氧化氮還原酶細胞色素P450(CYP450)[7]，本實驗選取cyp55a1基因作為研究對象，對水稻日本晴進行遺傳轉(zhuǎn)化得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，為研究該基因功能和NO對水稻的生理作用提供實驗材料.

1 材料和方法

1.1 材料

Cyp55a1基因為本實驗由尖鐮胞菌中克隆得到，表達載體pCAMBIA1302、水稻日本晴的種子，大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌EHA105宿主菌株均由中南民族大學武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室提供.

限制性內(nèi)切酶、pyrobest DNA聚合酶、DNA Marker、T4連接酶(TAKARA公司)，DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)，酵母粉、胰蛋白胨、總RNA提取試劑Trizol、羧芐(invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace-α-TM, 日本TOYOBO公司)，瓊脂糖(FMC公司)，其他試劑均為國產(chǎn)試劑分析純.引物由南京金斯瑞公司合成.

1.2 pCAMBIA1302-cyp55a1植物表達載體的構(gòu)建

用SDS堿裂解法提取pCAMBIA1302空載體質(zhì)粒和用Trizol試劑提取尖鐮胞菌的總RNA并將其反轉(zhuǎn)得到其cDNA.用設(shè)計的特異性引物(見表1)以cDNA作為模板進行PCR擴增.再將擴增產(chǎn)物與pCAMBIA1302空載體質(zhì)粒用NcoI和SpeI同時進行雙酶切，用T4連接酶將二者連接6 h.

表1 引物序列

其中R1比R2多一個終止密碼子，目的是為了阻止載體下游的GFP蛋白表達，防止GFP融合蛋白對CYP蛋白的功能造成影響.共構(gòu)建2個雙元表達載體：pCAMBIA1302-cyp55a1-gfp1和pCAMBIA1302-cyp55a1.

圖1 載體pCAMBIA1302-cyp55a1構(gòu)建流程圖Fig.1 The flow diagram for the construction of vector pCAMBIA1302-cyp55a1

1.3 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

參考李毓等[8]的方法，利用實驗室中保存好的成熟的野生型日本晴種子進行誘導2～3周及繼代培養(yǎng)4～6 d，用農(nóng)桿菌介導法侵染胚性愈傷，共培養(yǎng)2～3 d后進行篩選.2～3周后更換一次篩選培養(yǎng)基，2周后將長有白色抗性愈傷的進行分化培養(yǎng)，直到分化出綠色的小幼苗.將綠色幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，待植株長到瓶口處、根系發(fā)達后，打開瓶口加入一定量的無菌水進行煉苗，約1周后移栽到實驗田.

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的陽性鑒定

采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以cyp55a1基因的引物進行PCR檢測.電泳產(chǎn)物取3 μL進行檢測.

1.5 陽性植株的RT-PCR

采用Trizol法提取陽性轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，利用TOYOBO Rerver Tra Ace-α-TM 試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA.用內(nèi)參18sRNA引物對cDNA模板進行PCR鑒定，再按一定比例稀釋.用設(shè)計cyp55a1基因的RT-PCR引物和18sRNA引物同時對cDNA模板進行RT-PCR.

2 結(jié)果及分析

2.1 載體構(gòu)建

構(gòu)建的cyp55a1載體用引物F和R做PCR鑒定，cyp55a1-1302載體用NcoI內(nèi)切酶和SpeI內(nèi)切酶做雙酶切鑒定，cyp55a1基因為1203 bp， 2個載體均為陽性，測序結(jié)果正確.

2.2 遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株T0代的鑒定

將構(gòu)建好的pCAMBIA1302-cyp55a1超表達載體通過農(nóng)桿菌介導法侵染日本晴的愈傷組織，經(jīng)過誘導、篩選、分化、生根、煉苗，然后種植于田間.

取約5 cm的幼嫩葉片，以CTAB法提取基因組DNA為模板，使用cyp55a1引物(F，R)，以轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1302得到的轉(zhuǎn)基因日本晴為陰性對照，進行PCR檢測，鑒定T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株，共獲得了13株陽性苗(部分鑒定結(jié)果見圖4).

2.3 陽性植株的RNA水平的檢測

2.3.1 轉(zhuǎn)基因陽性植株幼苗RNA的提取及cDNA檢查

取5 cm左右的嫩葉，用Trizol試劑提取其總RNA(見圖5a)，電泳可見清晰的3條主帶，說明轉(zhuǎn)基因植株幼苗RNA提取成功.利用 TOYOBO Rerver Tra Ace-α-TM 試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA.用內(nèi)參18sRNA引物對cDNA模板進行PCR鑒定(見圖5b)，從圖5b可見單一的目的條帶，大小與預測相符，結(jié)果表明cDNA反轉(zhuǎn)成功，可用于RT-PCR實驗.

a) 總RNA電泳圖; b) cyp55a1目的片段PCR擴增電泳圖; c) cyp55a1/1302重組質(zhì)粒DNA電泳圖，1為空載1302;d) cyp55a1/1302重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖; e) pCAMBIA1302-cyp55a1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌后的質(zhì)粒PCR鑒定電泳圖圖2 重組質(zhì)粒鑒定圖Fig.2 Identification of recombinant plasmid

a)水稻胚性愈傷組織誘導；b)愈傷組織繼代培養(yǎng)；c)抗性愈傷組織篩選；d)愈傷組織分化成苗；e)轉(zhuǎn)化植株生根成苗圖3 遺傳轉(zhuǎn)化的過程圖Fig.3 Procedures of genetic transformation

a) T0代植株幼苗基因組DNA結(jié)果; b) T0代植株的PCR陽性鑒定圖4 T0代植株DNA提取及PCR陽性鑒定Fig.4 DNA extraction and positive identification of T0 generation plant by PCR

a) 轉(zhuǎn)基因陽性植株幼苗總RNA的電泳圖; b) RNA反轉(zhuǎn)得到的cDNA的PCR電泳圖(內(nèi)參18sRNA引物)圖5 陽性植株RNA的提取和反轉(zhuǎn)cDNA的檢測Fig.5 RNA extraction and cDNA testing of T0-generation

2.3.2 T0代陽性植株cyp55a1-ORF表達量的相對定量分析

按一定比例稀釋cDNA模板，用設(shè)計的RT-PCR引物55a1(F、R)和18sRNA引物(F、R)同時對cDNA模板進行RT-PCR. 結(jié)果表明，相比轉(zhuǎn)空載得到的日本晴植株，陽性植株的cyp55a1基因的表達水平得到不同程度的上調(diào)(見圖6)，說明cyp55a1基因在陽性植株中得到了表達，其中cyp55a1-A1-1,cyp55a1-A2-5,cyp55a1-A2-6和cyp55a1-A2-7這4個轉(zhuǎn)基因植株中cyp55a1基因表達較高，可用于后續(xù)的實驗材料.

圖6 To代陽性植株的RT-PCR結(jié)果Fig.6 RT-PCR results of T0 generations positive plants

3 結(jié)語

本實驗成功地將cyp55a1基因克隆到植物過表達載體pCAMBIA1302中，利用農(nóng)桿菌介導法進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了多個轉(zhuǎn)基因植株.對這些轉(zhuǎn)植株進行陽性鑒定和RNA水平表達量分析，結(jié)果表明：cyp55a1基因已成功插入到水稻基因組中，獲得了多個高表達的轉(zhuǎn)基因植株.本實驗獲得的高表達轉(zhuǎn)基因植株為cyp55a1基因功能和NO對水稻生理作用的后續(xù)研究提供了實驗材料.

參 考 文 獻

[1] Moncada S,Higgs A.The L-arginine-nitric oxide pathway[J]. N Engl J M, 1993, 329(27): 2002-2012.

[2] Wojtaszek P. Nitric oxide in plants: to NO or not [J]. Phytochemistry, 2000, 54(1): 1-4.

[3] Takahashi S, Yamasaki H. Reversible inhibition of pho-sphorylation in chloroplasts by nitric oxide[J]. FEBS Lett, 2002, 512(1/3): 145-148.

[4] Pagnussat G C, Simontacchi M, Puntarulo S, et al. Nitric oxide is required for root organogenesis[J]. Plant Physiol, 2002,129(3): 954-956.

[5] Durner J,Wendehenne D, Klessing D F. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(17):10328-10333.

[6] Pagnussat G C, Simontacchi M, Puntarulo S, et al. Nitric oxide is required for root organogenesis[J]. Plant Physiol, 2002,129(3): 954-956.

[7] Shoun H, Tanimoto T. Denitrification by the fungus Fusarium oxysporum and involvement of cytochrome P-450 in the respiratory nitrite reduction[J]. J Biol Chem, 1991, 266: 11078-11082.

[8] 李 毓, 洪國琴, 莊偉建, 等.水稻胚性愈傷誘導及其遺傳轉(zhuǎn)化的幾個技術(shù)參數(shù)研究[J].核農(nóng)學報,2008,22(4):394-398.