程國軍, 曾小波, 周艷琳, 田夢洋

(中南民族大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

近年來，由于人口的快速增長和工業(yè)化進程的加速，環(huán)境污染加劇，土壤遭到破壞，尤其是土壤重金屬污染.土壤重金屬污染的污染物在土壤中很難移動，滯留時間較長，難以被其他微生物降解，并可通過水、植物媒介的傳遞而影響人類生命健康[1].

為緩解土壤重金屬污染問題，國內(nèi)外專家曾采用非毒性改良劑法、深耕法、排土法、客土法及化學(xué)沖洗等方法，但受方法的局限性，均未能得到理想的治理效果.近年來，生物學(xué)方法因成本低、能耗小、無二次污染、處理效果好，具有廣泛的應(yīng)用前景[2].

本文從湖北大冶市某礦區(qū)某植物根際土樣中篩選到1株重金屬抗性菌CL01，并根據(jù)其形態(tài)和16S rRNA基因序列，對其進行了鑒定.在模擬銅污染土壤中種植紫云英，發(fā)現(xiàn)其具有較好的促進紫云英抵抗銅脅迫的作用，通過測定紫云英的生物量、植株不同部位的含銅量和土壤中不同狀態(tài)銅含量，進一步揭示了該細菌促進植物抵抗銅脅迫的機理，為重金屬污染土壤的微生物修復(fù)提供了重要的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

752型紫外可見光光度計(上海光譜儀器有限公司)，AA1700原子吸收分光光度計(浙江福立分析儀器有限公司)，DNA凝膠回收試劑盒(博大泰克)，2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰科生物技術(shù)有限公司)，pMD18-T Vector (寶生物工程大連有限公司)，測定分析所用試劑均為分析純，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn).

氯化銅(CuCl2·H2O)配成所需濃度，一次性拌入供試土壤.供試土壤取自中南民族大學(xué)生物實驗園，經(jīng)自然風(fēng)干后碾碎過2 mm篩，與洗凈風(fēng)干的砂等質(zhì)量混合.混合土壤含有機質(zhì)13.6 g/kg，速效氮58 mg/kg，速效磷19.7 mg/kg，速效鉀205 mg/kg，pH 6.65，有效銅0.43 mg/kg，全銅4.22 mg/kg.將供試土壤121 ℃滅菌1 h，連續(xù)滅菌2次，備用.

紫云英(Astragalussinicus)，本實驗室保存.細菌在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后離心收集菌體，用無菌水洗滌3次后制成菌懸液，懸液菌濃度約為1×109cfu/ml，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 重金屬抗性細菌的篩選和抗性水平

取湖北大冶市某礦區(qū)植物根圈的土樣1 g加入含有99 mL無菌蒸餾水并帶有玻璃珠的三角瓶中，放置于37 ℃搖床(200 r/min)振蕩30 min.靜置后取樣涂布含銅和鉻的Luria-Bertani平板中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待其長出菌后，挑取菌落進行純化培養(yǎng)，LB斜面4℃保存.

分別倒置含不同濃度梯度的重金屬LB平板，接種后于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察菌體生長情況，檢測細菌對不同重金屬的抗性水平.本實驗所用的重金屬鹽分別為：K2CrO4, ZnSO4·7H2O, CdCl2·2.5H2O, CuSO4·5H2O,NiSO4, MnCl2·4H2O和Pb(C2H3O2)·3H2O[3].

1.3 16S rDNA的PCR擴增和序列測定

取對數(shù)期的菌液，離心后收集菌體，抽提細菌基因組的總DNA.以基因組DNA為模板擴增16S rDNA.擴增引物選用細菌的通用PCR引物，正向引物(5′AAGGAGGTGATCCAGCC 3′)，反向引物(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′).PCR程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min.循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min[4].16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物先用瓊脂糖凝膠回收，再克隆到pMD18-T載體，經(jīng)過抽提質(zhì)粒、酶切和PCR驗證后，由北京三博遠志公司測序.

1.4 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過Blast程序，將測定的序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中己有的16S rDNA序列同源性比較分析，采用Bioedit和MAGE 4.0軟件以鄰位相連(Neighbor-Joining)法構(gòu)建進化樹.選取同源性高的菌株中各個不同屬的一些代表菌株用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[5].

1.5 盆栽實驗設(shè)計

將泥土裝入塑料盆中，選顆粒飽滿大小均勻的紫云英種子，用95%乙醇預(yù)處理5min，再用2%次氯酸鈉滅菌30 min，無菌水洗滌8～10次.種子在無菌水中充分吸漲后，均勻鋪于瓊脂平板，22 ℃倒置催芽2 d，催芽后的種子載入盆中.

實驗設(shè)4個處理：無菌無銅、有菌無銅、無菌有銅和有菌有銅，每個處理5個重復(fù).有銅組按75 mg/kg土壤一次性加入CuCl2溶液(銅溶液提前20 d加入，塑料盆下放一個托盤，將盆底流出的液體重新倒入花盆，以防銅流失).有菌組則在栽種3 d后于根系按每棵植株1mL加入菌懸液.培養(yǎng)過程在智能人工氣候培養(yǎng)箱中進行，設(shè)置白晝：20 ℃，18 h，濕度為70 %，光照強度3級；16 ℃，6 h, 濕度為70 %，光照強度0級.2 d澆1次營養(yǎng)液.培養(yǎng)35 d后，分根和地上2部分收集植株，并收集根際土壤.

1.6 植物生物量和銅含量的測定

分別測量紫云英根和地上部分長度，稱量鮮重.將各部分經(jīng)150 ℃烘干2 h，75 ℃下24 h，稱量干重.對紫云英根和地上部分進行消解，獲得上清液用分光光度計測定銅含量[6].提取根際土壤中可交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)的銅，并用分光光度計測定銅含量[7].

1.7 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計軟件分析相關(guān)數(shù)據(jù)的差異顯著性.

2 結(jié)果與討論

2.1 抗重金屬微生物的篩選和分離

從分離培養(yǎng)基平板中挑取單菌落，經(jīng)過篩選獲得一株能在含CuCl2和K2CrO4均為1 mM的培養(yǎng)基上生長良好的菌株CL01.在營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)2 d后可見其菌落邊緣整齊，表面濕潤，半透明，呈淺黃色.CL01菌株革蘭氏染色呈陰性，菌體桿狀，無芽孢.

2.2 Y3菌株對多種重金屬離子的抗性

本實驗測定了CuSO4·5H2O，K2CrO4，CdCl2·2.5H2O，ZnSO4·7H2O，NiSO4，MnCl2·4H2O和Pb(C2H3O2)·3H2O等7種重金屬對CL01菌株的最低抑菌濃度(見表1).結(jié)果表明：菌株CL01對不同重金屬離子的抗性各不相同，對鎘的抗性較弱，僅在含Cd2+濃度1 mmol/L的培養(yǎng)基上生長，而對Mn2+和Pb2+的抗性很強，其抗性濃度均達到了5 mmol/L.另外，菌株對Cr6+、Zn2+、Cu2+、Ni2+等重金屬離子的抗性濃度也均達到了2 mmol/L.對7種重金屬的抗性試驗分析表明，菌株CL01具有普遍較高的重金屬抗性能力.

表1 菌株CL01對多種重金屬離子的抗性

2.3 16S rRNA基因的克隆與序列分析

以菌株CL01的DNA為模板進行PCR，獲得一條約1.5 kb的特異性片度，經(jīng)回收、轉(zhuǎn)化后，挑選陽性克隆進行測序.利用Blast程序，將測序所得的16S rDNA部分序列和GenBank已登錄的16S rDNA序列進行核苷酸序列同源性比較，結(jié)果表明：菌株與Bordetella、Alcaligenes、Achromobacter等屬中多個種的16S rDNA序列具有高度同源性，與AchromobacterdenitrificansBMB-N6、AchromobacterxylosoxidansCONC18、B.bronchisepticaBb4、B.hinziiAU12584、Alcaligenesdenitrificans等菌的同源性均超過了99%.

2.4 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

將CL01菌株的16S rDNA部分序列提交GenBank進行Blast,下載同源性最高的12株不同屬的細菌16S rDNA，采用BioEdit軟件進行序列比對后采用MEGA4.1軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析(見圖1).由圖1可見，CL01菌株與Achromobacter菌屬的Achromobacterxylosoxidans細菌親緣關(guān)系最近，而與Alcaligenes和Achromobacter屬在進化上的距離相對較遠.依據(jù)前面形態(tài)學(xué)和染色觀察結(jié)果，可判定所分離的重金屬抗性菌株可能為Achromobacterxylosoxidans.在系統(tǒng)發(fā)育地位上則屬于Bacteria， Proteobacteria， Betaproteobacteria， Burkholderiales， Alcaligenaceae，Achromobacterxylosoxidans.

圖1 CL01菌株的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetical tree derived from the 16S rDNA sequence of strain CL01

2.5 銅脅迫下紫云英生長的測定

銅是植物生長必需的微量元素，但過量的銅會給植物的生長帶來毒害[8].在無菌有銅環(huán)境下生長的紫云英與對照組(無菌無銅組和有菌無銅組)相比，表現(xiàn)出明顯的外部形態(tài)上的諸如葉片出現(xiàn)斑紋、植株失綠和根系萎縮等明顯的重金屬中毒癥狀.可見該濃度下的Cu對紫云英的生長有抑制作用，這和此前有關(guān)銅離子對紫云英作用的報道相一致[9].而有菌有銅處理下植株的生長水平顯著提高，其植株地上部分高度為39.33 mm,根長為57.67 mm,植株鮮重為0.2278 g，達到了無菌無銅處理下植株的生長水平，二者均顯著高于無菌有銅處理下植株地上部分高度13.83 mm,根長12.33 mm,植株鮮重0.0386 g(見圖2)，說明CL01能促進紫云英抵抗Cu的脅迫作用，提高了紫云英的生長能力.

圖2 不同處理下對紫云英的生物量的差異Fig.2 The difference of biomass of Astragalus sinicus under various processing

2.6 銅含量的測定

與無銅對照組相比，加銅條件生長的紫云英根部銅吸取量顯著增加，表明銅脅迫會促使加大植株對銅的攝入量(見表2).然而，有菌有銅處理植株根部的銅攝取量為0.6 mg/kg , 遠低于無菌有銅對照處理攝取量1.74 mg/kg，表明CL01的存在顯著緩解了植株對銅離子的吸收.相比之下，紫云英地上部分所含銅濃度的變化不明顯.說明重金屬被紫云英吸收以后，大部分停留在根部，少量向地上部分遷移.此結(jié)果與已有研究報道一致[10].

紫云英根際土壤不同形態(tài)銅，結(jié)果表明：盡管CL01菌株對有銅處理根際土壤水溶態(tài)銅含量影響較小，有菌有銅處理根際土壤可交換態(tài)含量為2.62 mg/kg，顯著低于無菌有銅處理可交換態(tài)含量4.11 mg/kg(見表2)；而有菌有銅處理根際土壤鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)含量為17.96 mg/kg，高于無菌有銅處理可交換態(tài)含量11.51 mg/kg.根據(jù)植物根對土壤中重金屬吸收的難易程度，可將土壤中重金屬大致分為可吸收態(tài)、交換態(tài)和難吸收態(tài)3種狀態(tài).研究表明，土壤溶液中的金屬如游離離子易為植物根所吸收，結(jié)合態(tài)等難以被植物所吸收，而交換態(tài)介于兩者之間，主要包括被粘土和腐殖質(zhì)吸附的重金屬[11].鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)重金屬是以礦物的外囊物和細粉散顆粒存在，活性的鐵錳氧化物比表面積大，吸附或共沉淀陰離子而成[12].本研究表明：土壤中較高濃度的銅會對植物的生長產(chǎn)生毒害作用，而CL01菌株通過形成較高含量的鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)銅，有效降低了土壤中水溶態(tài)和可交換態(tài)銅含量，減少了植物對銅的吸取量，并降低了銅對植物的毒害作用.

表2 不同處理對紫云英植株含銅量和根際土壤銅濃度的影響

根部、可交換態(tài)、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)同列，與有菌有銅相比：*p< 0.05

3 結(jié)論

(1)本實驗篩選到的菌株CL01具有抗多種重金屬能力，經(jīng)16S rDNA序列比對，判斷該菌屬于Achromobacter.

(2)在模擬銅污染土壤中種植紫云英，發(fā)現(xiàn)其具有較好的促進紫云英抵抗銅脅迫的作用.在含銅環(huán)境下，加菌處理植株地上部分高度、根長、植株鮮重，達到了無菌無銅處理下植株的生長水平，二者均顯著高于無菌有銅處理下植株.表明CL01能促進紫云英抵抗Cu的脅迫作用，提高紫云英的生長能力.

(3)測定了根際土壤中水溶態(tài)、可交換態(tài)、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)的銅濃度，結(jié)果表明CL01菌株通過形成較高含量的鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)銅，有效降低了土壤中水溶態(tài)和可交換態(tài)銅含量，減少了植物對銅的吸取量，降低了銅對植物的毒害作用.

參 考 文 獻

[1] 羅戰(zhàn)祥, 揭春生, 毛旭東.重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)應(yīng)用[J].江西化工,2010(2):100-103.

[2] 邱廷省, 江樂勇, 唐海峰.礦山含銅重金屬廢水微生物處理試驗研究[J].礦冶工程,2005,25(3):50-57.

[3] 潘園園, 陳雯莉, 黃巧云.一株抗重金屬銅鎘細菌的分離、鑒定及其16S rDNA的序列分析[J].微生物學(xué)通報,2005,32(3):68-72.

[4] 國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T5749-2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,1987:2.

[5] Kumar S,Tamura K,Nei M. Integrated software for molecular evolut-ionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Brief Bioinform, 2004, 5(2):150-163.

[6] Huang Y, Xiong Z T, Dai L P, et al. Effect of Cu stress on the invertaseactivity and root growth in two populations ofRumexdentatusL. with different Cu tolerance[J]. Enviro Toxicol, 2008, 23(4):443-450.

[7] Tessier A,Campbell P G C,Bisson M S extraction procedure for the speciation of particulate trace metals. Anal Chem, 1979,51(7): 844-851.

[8] 張開明,黃蘇珍,原海燕,等．銅污染的植物毒害、抗性機理及其植物修復(fù)[J].江蘇環(huán)境科技,2005,18(1):4-9.

[9] 黃細花,趙振紀,劉永厚,等.銅對紫云英生長發(fā)育影響的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護,1993,12(1):1-6.

[10] 莫 爭,王春霞,陳 琴,等.重金屬Cu,Pb,Zn,Cr,Cd在水稻植株中的富集和分布[J].環(huán)境化學(xué), 2002, 21(2):110-116.

[11] 周啟星, 黃國宏. 環(huán)境生物地球化學(xué)及全球環(huán)境變化[M].北京:科學(xué)出版社, 2001.

[12] 楊宏偉, 王明仕, 徐愛菊, 等.黃河(清水河段)沉積物中錳、鈷、鎳的化學(xué)形態(tài)研究[J].環(huán)境科學(xué)研究,2001, 14(5):20-22.