陳娟，袁靖，吳晶晶，田潔，湯新逸，芮棵，田新宇，張悅，劉海冰，耿麗娜，楊珺，許化溪，王勝軍

（江蘇大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

Bcl-6基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及其與miR-346靶向關(guān)系的驗(yàn)證

陳娟，袁靖，吳晶晶，田潔，湯新逸，芮棵，田新宇，張悅，劉海冰，耿麗娜，楊珺，許化溪，王勝軍

（江蘇大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：構(gòu)建Bcl-6基因3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，分析miR-346對(duì)Bcl-6的調(diào)控作用。方法：通過(guò)PicTar數(shù)據(jù)庫(kù)和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能與Bcl-6基因3′UTR作用的miRNA；將人工合成的Bcl-6基因3′UTR區(qū)序列克隆至熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psiCHECK-2；將重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和miRNAmimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。結(jié)果：PicTar數(shù)據(jù)庫(kù)和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)交叉結(jié)果顯示，miR-346與Bcl-6基因3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確；重組質(zhì)粒和miR-346 mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶活性降低66%左右。結(jié)論：成功構(gòu)建了Bcl-6基因3′UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，篩選出和Bcl-6表達(dá)相關(guān)的miRNA即miR-346。

Bcl-6基因；微小RNA；3′非編碼區(qū)；熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒

B細(xì)胞淋巴瘤因子-6（B cell lymphoma 6，Bcl-6）是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子［1－3］，最初發(fā)現(xiàn)它是調(diào)節(jié)生發(fā)中心B細(xì)胞分化的主要因子［2］。Bcl-6通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因、DNA損傷反應(yīng)相關(guān)基因以及抑制大量的信號(hào)通路，包括B細(xì)胞受體信號(hào)，來(lái)控制生發(fā)中心B細(xì)胞的分化［2－4］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Bcl-6也可以調(diào)控濾泡輔助性T細(xì)胞（follicular helper T cells，Tfh）的分化發(fā)育。在體內(nèi)，組成性的過(guò)表達(dá)Bcl-6可以促使Tfh細(xì)胞分化，已分化的Tfh細(xì)胞表達(dá)高水平的Bcl-6［1，5－6］。微小RNA（miRNA）參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡等調(diào)控，其機(jī)制主要是根據(jù)核酸序列的互補(bǔ)性，miRNA結(jié)合到特定靶mRNA的3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR），通過(guò)調(diào)節(jié)靶mRNA的翻譯或者直接降解靶mRNA來(lái)調(diào)控目標(biāo)基因蛋白水平的表達(dá)［7］。有關(guān)miRNA的異常表達(dá)與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系引起學(xué)者們的極大關(guān)注，最初miRNA的研究主要集中在腫瘤方面，近幾年，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與多種自身免疫性疾病的發(fā)展密切相關(guān)［8－9］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可能調(diào)控免疫相關(guān)分子Bcl-6表達(dá)的miRNA，并構(gòu)建Bcl-6基因3′UTR熒光素酶報(bào)告載體，通過(guò)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bcl-6基因和miRNA的靶向關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎胚293T細(xì)胞、感受態(tài)大腸埃希菌DH5α（本實(shí)驗(yàn)室保存）。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco公司），無(wú)RNA酶離心管和槍頭（Axygen公司），miR-346 mimics及陰性對(duì)照購(gòu)于廣州銳博生物技術(shù)有限公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），限制性內(nèi)切酶NotⅠ及XhoⅠ（TaKaRa公司），熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psiCHECK-2（Promega公司），DNA連接試劑盒（TaKaRa公司），質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（Generay公司），雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（Promega公司）。

倒置顯微鏡（奧林巴斯公司），超凈工作臺(tái)（蘇州尚田潔凈有限公司），低溫臺(tái)式高速離心機(jī)和移液器（Eppendorf公司），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma公司），化學(xué)發(fā)光分析儀（Berthold公司）。

采用以下兩種預(yù)測(cè)軟件：miRanda（http：／／www.microrna.org），PicTar（http：／／pictar.mdc-berlin.de）

1.2 方法

1.2.1 靶基因預(yù)測(cè) 采用miRanda和PicTar兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Bcl-6，預(yù)測(cè)可能靶向作用于Bcl-6的miRNA，預(yù)測(cè)結(jié)果取交集，評(píng)分高者優(yōu)先，并結(jié)合文獻(xiàn)中報(bào)道的與自身免疫病相關(guān)的miRNA作為進(jìn)一步篩選的條件。

1.2.2 熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建 從基因庫(kù)中獲得Bcl-6基因3′UTR序列（基因號(hào)NM＿001706），設(shè)計(jì)并合成位于Bcl-6基因3′UTR區(qū)涵蓋miR-346兩個(gè)作用位點(diǎn)的一段序列，分別在5′加上XhoⅠ內(nèi)切酶，3′加NotⅠ內(nèi)切酶。由上海生工生物有限公司合成，長(zhǎng)152 bp，連接于pUC57載體上。具體序列：5′-CTCGAGGAATCTACCCAAAGGATACTGTAACACTTTACAGCTCGATTTTGTATCTGCAGGCAGACACGGATCTGAGAATCTTTATTGAGAAAGAGCACTTAAGAGTGCACCATCCCTTTTTGAAGTGTAGGCAGACACAGGGACGCGGCCGC-3′。雙酶切連有目的片段的pUC57質(zhì)粒和psiCHECK-2空載，回收152 bp目的片段和psiCHECK-2載體片段，T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，挑選陽(yáng)性單菌落搖菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切（XhoⅠ／NotⅠ）鑒定。鑒定正確后的質(zhì)粒命名psiCHECK-3′UTR，并送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎胚293T細(xì)胞加入到含10%胎牛血清（FBS）的DMEM，置于37℃恒溫、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 miRNA mimics及陰性對(duì)照凍干粉離心后分別根據(jù)miRNA產(chǎn)品使用說(shuō)明書要求，用相應(yīng)量的DEPC水溶解。使用24孔培養(yǎng)板，于轉(zhuǎn)染前1天接種適當(dāng)數(shù)目的293T細(xì)胞至板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30%～50%。參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)共分4組，分別為psi-CHECK-2空載與陰性對(duì)照，psiCHECK-2空載與miR-346 mimic，psiCHECK-3′UTR與陰性對(duì)照，psi-CHECK-3′UTR與miR-346 mimic。每組設(shè)3個(gè)平行孔，以psiCHECK-2空載與陰性對(duì)照組作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染后48 h時(shí)裂解細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.5 熒光素酶活性測(cè)定 除去細(xì)胞中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次。將1×PLB 100μL加入到24孔培養(yǎng)板中，室溫輕緩晃動(dòng)培養(yǎng)板15 min，將裂解液轉(zhuǎn)移到檢測(cè)試管中。事先在檢測(cè)管中加入100μL LARⅡ，設(shè)置熒光發(fā)光儀程序。轉(zhuǎn)移20μL PLB裂解液到檢測(cè)管中，混合，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的活性，向檢測(cè)管中加入100μL Stop＆Glo?試劑，檢測(cè)海腎熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 靶向關(guān)系預(yù)測(cè)

以Bcl-6為目的基因，經(jīng)過(guò)miRanda和PicTar兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)交叉結(jié)果顯示，miR-346在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均評(píng)分最高，靶向作用于Bcl-6的可能性最大。因此，選miR-346做進(jìn)一步的研究。圖1為數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出的miR-346與Bcl-6 3′UTR作用的位點(diǎn)。

圖1 m iR-346與Bcl-6 3′UTR作用的位點(diǎn)

2.2 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

設(shè)計(jì)并合成位于Bcl-6基因3′UTR區(qū)涵蓋miR-346兩個(gè)作用位點(diǎn)的一段序列，分別在5′加上XhoⅠ內(nèi)切酶，3′加上NotⅠ內(nèi)切酶，將目的基因與psi-CHECK-2載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌得到重組質(zhì)粒，雙酶切法鑒定陽(yáng)性克隆，可觀察到與目的片段152 bp相符的條帶（圖2），由上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序后證實(shí)與設(shè)計(jì)合成的序列完全吻合。

圖2 psiCHECK-3′UTR重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)

將miR-346 mimics與psiCHECK-3′UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，以psiCHECK-2空載體和陰性對(duì)照組作為陰性對(duì)照，測(cè)定各組細(xì)胞熒光素酶活性，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)2次。如果miRNA與對(duì)應(yīng)的靶基因相互作用，則表現(xiàn)為細(xì)胞熒光素酶活性下降。圖3顯示，miR-346對(duì)psiCHECK-3′UTR重組質(zhì)粒的熒光素酶表達(dá)有比較明顯的抑制作用，熒光素酶活性降低66%左右。說(shuō)明miR-346通過(guò)與Bcl-6的3′UTR相互作用，抑制Bcl-6蛋白水平的表達(dá)。

圖3 各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)情況

3 討論

Bcl-6基因最初是研究非霍奇金淋巴瘤免疫基因圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因［10］，屬于轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，能結(jié)合到靶基因DNA序列上抑制含有識(shí)別位點(diǎn)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。Bcl-6主要表達(dá)于生發(fā)中心的B細(xì)胞和CD4＋T細(xì)胞，參與淋巴細(xì)胞分化、控制生發(fā)中心形成和調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴的抗原反應(yīng)。受Bcl-6調(diào)控的基因包括blimp-1、CD44、細(xì)胞周期蛋白D2、IP-10等［11－12］。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-6過(guò)表達(dá)會(huì)使生發(fā)中心內(nèi)的B細(xì)胞不能按正常途徑發(fā)育成熟，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種小分子非編碼RNA，廣泛存在于病毒、植物以及動(dòng)物體內(nèi)，參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡等調(diào)控。成熟miRNA通過(guò)識(shí)別靶mRNA的3′UTR區(qū)，降解靶基因或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的［7］。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，約1／3的mRNA受miRNA調(diào)控。一個(gè)miRNA可作用于多個(gè)靶基因，多個(gè)miRNA也可以共同調(diào)控同一個(gè)靶基因。目前，已發(fā)現(xiàn)的人miRNA有700多個(gè)，免疫細(xì)胞中表達(dá)100多種miRNA，這些miRNA在固有免疫及適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮著重要作用［8－9］。

本實(shí)驗(yàn)首先采用miRanda和PicTar兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了可能與免疫相關(guān)分子Bcl-6相互作用的miRNA，篩選出miR-346作為進(jìn)一步研究對(duì)象。然后通過(guò)構(gòu)建Bcl-6 3′UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒以及與miR-346 mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性的變化，證實(shí)miR-346可以靶向作用于Bcl-6基因，調(diào)控其蛋白水平表達(dá)。

［1］ Crotty S，Johnston RJ，Schoenberger SP.Effectors and memories：Bcl-6 and Blimp-1 in T and B lymphocyte differentiation［J］.Nat Immunol，2010，11（2）：114－120.

［2］ Klein U，Dalla-Favera R.Germinal centres：role in B-cell physiology and malignancy［J］.Nat Rev Immunol，2008，8（1）：22－33.

［3］ Parekh S，Priv G，Melnick A.Therapeutic targeting of the BCL6 oncogene for diffuse large B-cell lymphomas［J］.Leuk Lymphoma，2008，49（5）：874－882.

［4］ Basso K，Saito M，Sumazin P，et al.Integrated biochemical and computational approach identifies BCL6 direct target genes controllingmultiple pathways in normal germinal center B cells［J］.Blood，2010，115（5）：975－984.

［5］ Fazilleau N，McHeyzer-Williams LJ，Rosen H，et al.The function of follicular helper T cells is regulated by the strength of T cell antigen receptor binding［J］.Nat Immunol，2009，10（4）：375－384.

［6］ Johnston RJ，Poholek AC，DiToro D，et al.Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation［J］.Science，2009，325（5943）：1006－1010.

［7］ Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms：growth，death，fat，stress，and timing［J］.Cell，2003，113（6）：673－676.

［8］ Aringer M，GraningerWB，Steiner G，et al.Safety and efficacy of tumor necrosis factor alpha blockade in systemic lupus erythematosus：an open-label study［J］.Arthritis Rheum，2004，50（10）：3161－3169.

［9］ Chambers SA，Isenberg D.Anti-B cell therapy（rituximab）in the treatmentof autoimmune diseases［J］.Lupus，2005，14（3）：210－214.

［10］ Zollman S，Godt D，Priv GG，et al.The BTB domain，found primarily in zinc finger proteins，defines an evolutionarily conserved family that includes several developmentally regulated genes in Drosophila［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，1994，91（22）：10717－10721.

［11］ OhtaniM，Miyadai T.Functional analysis of fish Bcl-6 and Blimp-1 in vitro：transcriptional repressors for B-cell terminal differentiation in fugu（Takifugu rubripes）［J］.Mol Immunol，2011，48（6／7）：818－825.

［12］ Shaffer AL，Yu X，He Y，et al.Bcl-6 represses genes that function in lymphocyte differentiation，inflammation，and cell cycle control［J］.Immunity，2000，13（2）：199－212.

Construction of Bcl-6 gene 3′UTR dual luciferase reporter vector and targeting verification between Bcl-6 and m iR-346

CHEN Juan，YUAN Jing，WU Jing-jing，TIAN Jie，TANG Xin-yi，RUIKe，TIAN Xin-yu，ZHANG Yue，LIU Hai-bing，GENG Li-na，YANG Jun，XU Hua-xi，WANG Sheng-jun
（Institution of Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To construct a luciferase reporter vector containing the 3′untranslated region（3′UTR）of Bcl-6 gene andmeasure the correlation between Bcl-6 andmiR-346.M ethods：ThemiRNA targeting Bcl-6 3′UTR was predicted bymiRanda and PicTar.The synthetic 3′UTR fragmentof Bcl-6 was cloned into PsiCHECK-2 reporter vector.The luciferase reporter vector and miRNA mimics were transfected into 293T cells.The relative luciferase activity was detected.Results：PicTar andmiRanda database shared the results thatmiR-346 have the complementary binding siteswith 3′UTR of Bcl-6.Results of double enzyme digestion and DNA sequencing showed that sequence of luciferase reporter vector was correct.The luciferase activity of reporter vector treatingmiR-346 was decreased observably about66%.Conclusion：The luciferase reporter vector containing the 3′UTR of Bcl-6 was constructed successfully.

Bcl-6；microRNA；3′untranslated region；luciferase reporter vector

R561.4

A

1671－7783（2014）02－0122－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130121

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81072453，31170849，30972748）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2011472）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CXLX11＿0608）；江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（Z201313）；江蘇省“青藍(lán)工程”項(xiàng)目（蘇教師［2010］27號(hào)）

陳娟（1988—），女，碩士研究生；王勝軍（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：sjwjs＠m(xù)ail.ujs.edu.cn

2013－06－04 ［編輯］陳海林