張斌斌，陳義鋼，丁厚中*

（1.昆山市中醫(yī)院病理科，江蘇昆山215300；2.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院綜合外科，江蘇昆山215300）

膽囊癌組織中微淋巴管密度的檢測(cè)意義

張斌斌1，陳義鋼2，丁厚中2*

（1.昆山市中醫(yī)院病理科，江蘇昆山215300；2.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院綜合外科，江蘇昆山215300）

目的：探討使用D2-40（淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物）檢測(cè)膽囊癌組織中微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）的臨床意義。方法：應(yīng)用組織芯片和免疫組織化學(xué)（S-P法）技術(shù)以D2-40單克隆抗體檢測(cè)59例膽囊癌（其中肝臟侵犯13例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例）的癌中心與癌周組織和6例正常膽囊組織中LMVD的表達(dá)，并分析其與膽囊癌病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：LMVD在膽囊癌周邊組織中的表達(dá)明顯高于正常膽囊組織和癌中心組織中的表達(dá)（P＜0.01）。在膽囊癌中，D2-40陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、年齡、肝臟侵犯無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與膽囊癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期（Nevin分期）有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：D2-40可以特異性識(shí)別人膽囊癌組織中微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，其標(biāo)記的微淋巴管主要分布于癌周組織；LMVD可用來(lái)評(píng)估膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

組織芯片；膽囊癌；D2-40

膽囊癌是預(yù)后較差的惡性腫瘤之一，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)現(xiàn)多為晚期［1］，其轉(zhuǎn)移途徑大多通過(guò)直接轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移等，腫瘤細(xì)胞侵犯進(jìn)入淋巴管及腫瘤內(nèi)淋巴管侵犯（lymphatic vessel invasion，LVI）是腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要步驟［2－3］。以往外科手術(shù)大多主張行膽囊癌擴(kuò)大根治術(shù)，而目前臨床上對(duì)膽囊癌的外科大范圍淋巴結(jié)清掃尚存在著不同爭(zhēng)論［4］，因此有必要對(duì)膽囊癌組織、癌旁組織與正常膽囊組織中的淋巴管密度等進(jìn)行相關(guān)研究，從而為外科淋巴結(jié)大范圍清掃價(jià)值的討論提供參考。2002年Kahn等［5］發(fā)現(xiàn)了一種比較特異的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物D2-40，其抗體對(duì)淋巴管上皮有較高的特異性和敏感性，可用于淋巴管形成和計(jì)數(shù)研究［6］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）與膽囊癌相互關(guān)系的研究較少，本研究以D2-40單克隆抗體應(yīng)用組織微陣列、免疫組織化學(xué)技術(shù)（S-P法）檢測(cè)了膽囊癌、癌旁組織和正常膽囊中LMVD的表達(dá)情況，并嘗試探討LMVD與膽囊癌生物學(xué)行為的相關(guān)性及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

組織芯片為我科室構(gòu)建保存。該芯片（圖1）含有59例膽囊癌術(shù)后標(biāo)本，其中男21例，女38例。60歲以下21例，60歲及60歲以上38例，平均年齡63.7歲。病理診斷結(jié)果經(jīng)兩名以上病理醫(yī)師確認(rèn)。腺癌54例，腺鱗癌4例，未分化癌1例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，肝臟侵犯13例。臨床分期采用膽囊癌Nevin分期（1976），其中Ⅰ期5例（8.5%），Ⅱ期8例（13.6%），Ⅲ期21例（35.6%），Ⅳ期7例，（11.9%），V期18例（30.5%）。另取6例正常膽囊組織標(biāo)本（上海第二軍醫(yī)大學(xué)尸檢標(biāo)本）作對(duì)照。

圖1 膽囊癌組織芯片

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

1.2.1 抗體來(lái)源 鼠抗人D2-40單克隆抗體（即用型）及S-P免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。免疫組化技術(shù)采用S-P法，PBS替代一抗作陰性對(duì)照。1.2.2 結(jié)果判斷 D2-40抗體標(biāo)記的淋巴管判斷標(biāo)準(zhǔn)：棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞形成的條狀管腔或隙狀管腔，以胞質(zhì)或胞膜呈清晰棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。先在低倍鏡（×40或×100）下掃描膽囊癌腫瘤周邊區(qū)（即腫瘤組織與正常組織交接的區(qū)域）、腫瘤中心區(qū)，選擇其中高淋巴管密度區(qū)，然后在高倍鏡（× 400）下計(jì)數(shù)被D2-40抗體染成棕色的淋巴管數(shù)目，每個(gè)染成棕色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要與鄰近脈管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開，即視為一個(gè)淋巴管。結(jié)果以5個(gè)高倍視野下的淋巴管均數(shù)表示。分別測(cè)定膽囊癌腫瘤中心區(qū)、周邊區(qū)以及正常膽囊組織的LMVD。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有結(jié)果均在SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包上進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，兩個(gè)樣本均數(shù)之間的比較采用t檢驗(yàn)，3個(gè)樣本均數(shù)之間的比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽囊癌中D2-40的表達(dá)

D2-40的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜，為棕黃色顆粒，淋巴管形態(tài)呈管狀或裂隙狀，周邊區(qū)淋巴管數(shù)量較多，而中心區(qū)數(shù)量較少。見圖1。

膽囊癌周組織LMVD為8.91～16.35個(gè)，平均為（13.38±2.45）個(gè)；中心區(qū)LMVD為2.41～7.30個(gè)，平均為（4.90±1.90）個(gè)；正常組織LMVD為1.92～3.67個(gè)，平均為（2.70±0.83）個(gè)。癌周邊區(qū)LMVD明顯高于中心區(qū)和正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝22.881，P＜0.01；t＝8.130，P＜0.01）。

圖1 膽囊癌周邊區(qū)及中心區(qū)免疫組化結(jié)果（S-P法×100）

2.2 膽囊癌LMVD與臨床病理參素間的關(guān)系

膽囊癌周邊區(qū)LMVD與腫瘤的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與患者的年齡、性別、肝臟侵犯均無(wú)關(guān)（P＞0.05），見表1。

表1 膽囊癌組織中LMVD的陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

腫瘤的形成與生長(zhǎng)是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程［7］，其中腫瘤誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)淋巴管生成與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)［8］。腫瘤組織內(nèi)新生的腫瘤相關(guān)淋巴管僅由單層細(xì)胞組成，無(wú)基底層結(jié)構(gòu)，并且內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接少，存在較多腔隙，這些因素都有利于腫瘤細(xì)胞的淋巴管轉(zhuǎn)移。而由于淋巴管特異性標(biāo)志物的缺乏，對(duì)腫瘤淋巴管的研究一直存在爭(zhēng)議，并因?yàn)槿狈A(chǔ)理論的支持，臨床上對(duì)大范圍淋巴結(jié)清掃的價(jià)值一直存在爭(zhēng)論。

D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的一種相對(duì)分子質(zhì)量為40 000的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，大量研究表明其作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的一種特異性標(biāo)志物可用于識(shí)別正常和腫瘤組織中的淋巴管。D2-40可與癌胚抗原M2A特異性結(jié)合，M2A表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞而不表達(dá)于血管內(nèi)皮，因此D2-40被廣泛應(yīng)用于腫瘤淋巴管與腫瘤生物學(xué)關(guān)系的研究，是目前相對(duì)較好的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物［9－10］。Choi等［11］通過(guò)RT-PCR和免疫組化技術(shù)對(duì)29例乳腺癌標(biāo)本用D2-40作淋巴管密度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)癌組織中淋巴管密度不僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度有關(guān)，而且可以用來(lái)估計(jì)腫瘤的轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后情況。Cao等［12］用D2-40對(duì)1 072例胃癌標(biāo)本作免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示LVI是胃瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要步驟，LVI與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，N分期越高，LVI發(fā)生率也升高。

本研究中，D2-40染色陽(yáng)性的微淋巴管顯示清晰，與周圍背景色對(duì)比良好，充分表明D2-40標(biāo)記淋巴管特異性強(qiáng)，能夠很好區(qū)別微血管與微淋巴管，可作為臨床病理上鑒別膽囊癌微淋巴管的可靠標(biāo)志物。本研究通過(guò)對(duì)59例膽囊癌癌周及癌中心組織和6例正常膽囊組織微淋巴管的標(biāo)記和計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，膽囊癌周邊組織中LMVD的表達(dá)明顯高于癌中心組織（P＜0.01），可能反映了癌細(xì)胞向周圍侵襲的生物學(xué)特性以及淋巴管在該過(guò)程的重要性；本研究結(jié)果顯示LMVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Nevin分期相關(guān)，N分期越高，LMVD發(fā)生率也升高，說(shuō)明LMVD與膽囊癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及侵襲潛力有密切關(guān)系，LMVD可能是反映膽囊癌預(yù)后的重要客觀指標(biāo)。本研究顯示，膽囊癌周邊區(qū)淋巴管呈不規(guī)則形擴(kuò)張，而在膽囊癌中心區(qū)淋巴管數(shù)量明顯減少，僅有少數(shù)淋巴管呈不規(guī)則狀擴(kuò)張，明顯不及腫瘤周邊微淋巴管數(shù)量多。膽囊癌周邊區(qū)LMVD明顯高于中心區(qū)和正常組織，該現(xiàn)象可能提示膽囊癌中淋巴管的形成主要位于周邊區(qū)，并且是有功能的，中心區(qū)淋巴管則大多數(shù)為無(wú)功能的，不過(guò)具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究應(yīng)用D2-40標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮，對(duì)膽囊癌、癌旁組織和正常膽囊中D2-40的不同表達(dá)作相關(guān)分析，證明LMVD與膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Nevin分期相關(guān)，N分期越高，LMVD密度也高。本文再一次佐證了臨床上根據(jù)膽囊癌Nevin分期的不同選擇不同的淋巴結(jié)清掃范圍（Ⅰ期單純膽囊切除、Ⅱ期采用根治手術(shù)，Ⅲ、Ⅳ期根據(jù)腫瘤侵犯不同的部位或器官采取不同的擴(kuò)大根治術(shù)）有一定的科學(xué)性。但本研究病例數(shù)較少，相關(guān)隨訪資料正在完善中，對(duì)LMVD與膽囊癌關(guān)系的研究尚不深入，仍需開展更進(jìn)一步及更大規(guī)模的研究以證明LMVD在膽囊癌研究中的臨床意義及判斷預(yù)后的價(jià)值。

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R735.8

B

1671－7783（2014）02－0169－03

10.13312／j.issn.1671-7783.y130270

*：通訊作者，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：dinghouzhong＠163.com

2013－12－05 ［編輯］ 何承志