賀志龍 夏偉 馮璜 許春芳

二甲雙胍是一種傳統(tǒng)的口服降糖藥，一直用于2型糖尿病的治療。然而，2005年Evans等[1]通過流行病學(xué)研究首次報(bào)道了二甲雙胍能夠明顯地降低2型糖尿病患者的腫瘤發(fā)病率。后有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了二甲雙胍的抗腫瘤作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌等[2-4]。目前有臨床研究證實(shí)，二甲雙胍能顯著降低糖尿病患者患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。本研究應(yīng)用二甲雙胍干預(yù)人胰腺癌細(xì)胞株CFPAC-1，觀察干預(yù)后細(xì)胞增殖及凋亡的變化，探討二甲雙胍抗胰腺癌的相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

一、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

人胰腺癌細(xì)胞株CFPAC-1由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血研所惠贈(zèng)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104/ml。96孔板的每孔中加入100 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，分別加入含1、2.5、5、10、20、40、60 mmol/L二甲雙胍(Sigma公司)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液(日本同仁公司)10 μl，37℃孵育4 h。以未處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，以培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后上酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)。以空白對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A450值)。細(xì)胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)=(對(duì)照組A450值-處理組A450值)/對(duì)照組A450值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

二、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)棄培養(yǎng)液，加入含10、20、40 mmol/L二甲雙胍培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以未處理細(xì)胞作為對(duì)照組。用含EDTA的胰酶消化后收集各組細(xì)胞，PBS洗滌、離心3次，加入 70%乙醇，置4℃過夜。PBS洗滌2次后，加入碘化丙啶(PI)染色液(碧云天公司)，置37℃避光溫浴30 min，上BIOLISA流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

三、Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理48 h及未處理的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化后收集各組細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入1×Binding Buffer 500 μl、Annexin V-FITC(Molecular Probes公司)5 μl、PI 1 μl混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

四、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理48 h及未處理的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，用裂解液裂解細(xì)胞獲取蛋白，用BCA比色法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)磷酸化AMPK(p-AMPK)、脂肪合酶(FAS)、cyclin D1、Bcl-xl、Bax、caspase-3、survivin蛋白表達(dá)。兔抗人p-AMPK、FAS、Bcl-xl、Bax一抗均購(gòu)自EPITMICE公司，鼠抗人caspase-3和cyclin D1抗體、兔抗人survivin抗體、鼠抗人β-actin單抗、羊抗兔及羊抗鼠二抗均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。最后ECL發(fā)光，X膠片曝光、顯影和定影。應(yīng)用圖像分析儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值比表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、二甲雙胍對(duì)CFPAC-1細(xì)胞增殖的影響

二甲雙胍呈濃度及時(shí)間依賴性抑制人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)(表1)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。培養(yǎng)48 h時(shí)的IC50濃度約為20 mmol/L。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與24 h抑制率比較，bP<0.05；與48 h抑制率比較，cP<0.05

二、二甲雙胍對(duì)CFPAC-1細(xì)胞周期的影響

10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理CFPAC-1細(xì)胞48 h后，G0/G1細(xì)胞比例顯著增多(表2)，G2/M期、S期細(xì)胞比例顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

表2 二甲雙胍對(duì)CFPAC-1細(xì)胞周期的影響

三、二甲雙胍對(duì)CFPAC-1細(xì)胞凋亡的影響

10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理CFPAC-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(13.77±1.31)%、(22.63±1.45)%、(32.97±3.19)%，較對(duì)照組的(3.01±0.49)%均有顯著增加(F=136.903，P<0.05，圖1)。

圖1 對(duì)照組(a)及10、20、40 mmol/L二甲雙胍(b、c、d)處理CFPAC-148 h后的凋亡細(xì)胞

四、二甲雙胍對(duì)CFPAC-1細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

不同濃度二甲雙胍處理CFPAC-1細(xì)胞48 h后，p-AMPK、Bax、caspase-3表達(dá)明顯增強(qiáng)，F(xiàn)AS、cyclin D1，Bcl-xl、survivin表達(dá)減弱(圖2，表3)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示二甲雙胍處理后AMPK信號(hào)通路激活，細(xì)胞凋亡增加。

圖2 對(duì)照組(1)及10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理組(2、3、4)CFPAC-1細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

討 論

糖尿病與胰腺癌的關(guān)系復(fù)雜，一方面糖尿病是胰腺癌早期癥狀之一，另一方面糖尿病已經(jīng)是僅次于吸煙、肥胖之后的胰腺癌發(fā)病的第三大危險(xiǎn)因素[7-8]。作為治療2型糖尿病一線藥物的二甲雙胍在抗胰腺癌方面的研究顯得格外重要，并更具臨床意義。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，其磷酸化后形成的p-AMPK是AMPK的活化形式。AMPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝最重要的“傳感器”，激活的p-AMPK能夠抑制細(xì)胞能量代謝，抑制細(xì)胞合成蛋白質(zhì)、脂肪酸等物質(zhì)[9]，并可抑制AMPK信號(hào)通路下游多種因子的生成及活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡，最終影響腫瘤細(xì)胞的增殖[10]。在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍抗腫瘤作用與激活A(yù)MPK信號(hào)通路有關(guān)[2,4]。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍處理CFPAC-1細(xì)胞48 h后能顯著增加p-AMPK表達(dá)量，提示二甲雙胍可激活A(yù)MPK信號(hào)通路。

FAS是脂肪酸生物合成過程中將小分子碳單位聚合成長(zhǎng)鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶。腫瘤細(xì)胞的脂肪酸代謝與正常組織細(xì)胞不同，其依賴于細(xì)胞內(nèi)FAS來(lái)合成脂肪酸以滿足癌細(xì)胞分裂、增殖的需要[11]。在胰腺癌組織中FAS水平也顯著升高，并與胰腺癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍處理CFPAC-2細(xì)胞后，F(xiàn)AS的蛋白下調(diào)，提示AMPK信號(hào)通路激活后可抑制FAS合成[13]。

表3 二甲雙胍處理CFPAC-1細(xì)胞48 h后相關(guān)蛋白的表達(dá)量

Cyclin D1在調(diào)控細(xì)胞增殖周期G1期到S期的轉(zhuǎn)換中起著重要的作用。有研究表明，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK從而抑制mTOR，導(dǎo)致下游靶分子解磷酸化，進(jìn)而下調(diào)cyclin D1的表達(dá)，將腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期[14-15]。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍處理CFPAC-1細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例增多，S期及G2/M期細(xì)胞比例減少，證實(shí)二甲雙胍通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路而下調(diào)cyclin D1的表達(dá)，阻滯細(xì)胞于G0期/G1期，抑制細(xì)胞增殖。

腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞增殖異常有關(guān)，同時(shí)也與細(xì)胞凋亡異常有密切關(guān)系。Bcl-xl是一種經(jīng)典的凋亡抑制基因，Bax為凋亡促進(jìn)基因，caspase-3則是凋亡途徑最終的效應(yīng)因子。Bcl-xl/Bax比值下調(diào)可破壞線粒體外膜完整性，釋放細(xì)胞色素C等進(jìn)入胞質(zhì)，激活caspase-3，進(jìn)而引起染色體斷裂、細(xì)胞凋亡[16]。survivin是一種凋亡抑制蛋白，可直接抑制caspase-3活性而有效阻斷細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍處理CFPAC-1細(xì)胞后Bcl-xl表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-xl/Bax比值降低，survivin表達(dá)下調(diào)，caspase-3表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)CFPAC-1細(xì)胞凋亡。

參 考 文 獻(xiàn)

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