王小紅 魏榮龍 儲磊 胡江鴻 沈云志

重癥急性胰腺炎(SAP)并發(fā)腦損傷，又稱胰性腦病(pancreatic encephalopathy，PE)，是SAP常見的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為定向力障礙、意識模糊、幻覺等精神狀態(tài)異常。臨床SAP并發(fā)PE約占同期患者的18.2%，病死率達67.0%。

目前PE的發(fā)病機制尚未完全清楚，而胰酶作用學說及炎癥遞質(zhì)作用學說得到廣泛關注[1]。本研究應用舒血寧及奧曲肽治療急性壞死性胰腺炎(ANP)并發(fā)腦損傷大鼠，觀察兩者聯(lián)合的療效，探討其可能的作用機制。

一、資料與方法

1．實驗動物及分組：健康雄性遠交系大鼠180只，體質(zhì)量250～305 g，鼠齡43～49 d，購自南通大學醫(yī)學院實驗動物中心。應用隨機數(shù)字表法分為對照組、ANP組、舒血寧組、奧曲肽組、舒血寧和奧曲肽聯(lián)合處理(聯(lián)合)組及陽性對照的烏司他丁組，每組30只。?；悄懰徕c(95%)購自Sigma公司；舒血寧為石家莊神威藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，國藥準字號Z13020795；奧曲肽為瑞士諾華制藥有限公司產(chǎn)品，國藥準字號H20090924；烏司他丁為廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，國藥準字號H19990132。參照Kaplan等[2]方法采用胰膽管逆行注入5%?；悄懰徕c0.1 ml/100 g體質(zhì)量方法制備大鼠ANP并發(fā)腦損傷模型。造模后6 h，舒血寧組大鼠經(jīng)股靜脈注射舒血寧0.5 ml/100 g體質(zhì)量(配方：5%葡萄糖液250 ml+舒血寧注射液20 ml+普通胰島素3U)，每日1次；奧曲肽組皮下注射奧曲肽0.5 μg/100 g體質(zhì)量，每6 h 1次；聯(lián)合組分別給予舒血寧0.5 ml/100 g體質(zhì)量，每日1次，奧曲肽0.5 μg/100 g體質(zhì)量，每6 h 1次(不混合)；烏司他丁組給予靜脈注射烏司他丁1 ml/100 g體質(zhì)量(配方：0.9%氯化鈉500 ml+烏司他丁10萬U)，每8 h 1次。對照組開腹輕觸摸胰腺后關腹，術(shù)后6 h給予等容積生理鹽水，每天1次。

給藥后即刻(造模后6 h)、造模后24 h分兩批處死各組大鼠，腹主動脈取血，分離血清，置-20℃冰箱保存，取胰腺組織，乙醛固定，取腦組織，液氮冷凍保存。

2．血清磷脂酶A2(PLA2)、TNF-α、IL-6含量測定：采用陳氏法[3]測定PLA2，采用放射免疫法檢測TNF-α、IL-6含量。TNF-α、IL-6放免試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴格按試劑盒說明進行操作。

3．胰腺病理學檢查：胰腺組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片、HE染色，由?？漆t(yī)師盲法在光鏡下閱片，并參照Schmidt等[4]標準進行病理評分。

4．腦組織含水量測定：從液氮中取出后稱腦濕重，然后置于真空恒溫干燥箱100℃烘烤24 h。稱干重，計算腦組織含水量。腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

5．腦組織病理學及電鏡檢查：取部分新鮮腦組織，常規(guī)行病理學檢查，由?？漆t(yī)師盲法在光鏡下閱片，參照孔雷等[5]方法進行病理評分。腦組織電鏡標本制作及觀察由南通大學神經(jīng)再生重點實驗室專業(yè)老師指導進行。

6．腦組織TNF-α、IL-6 mRNA檢測：采用RT-PCR法檢測。TNF-α、IL-6及內(nèi)參GAPDH的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。引物序列：TNF-α 正義為 5′-CGCCACCGGCAAGGATTCCA-3′，反義為5′-TCCCAACGCTGGGTCCTCCA-3′，產(chǎn)物335 bp；IL-6正義為5′-CAAGAGACTTCCAGCCAGTTGC-3′，反義為5′-TTGCCGAGTAGACCTCATAGTGACC-3′，產(chǎn)物614 bp；內(nèi)參GAPDH正義為5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反義為5′-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3′，產(chǎn)物239 bp。PCR反應條件：95℃ 5 min，95℃ 20 s、55℃ 30 s、72℃ 40 s，循環(huán)35次，再72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，用凝膠成像儀掃描，Image J軟件分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示mRNA相對表達量。

二、結(jié)果

1．大鼠存活率：各組大鼠6 h內(nèi)均無死亡。24 h時ANP組9只死亡，存活率40%；舒血寧組7只死亡，存活率53.3%；奧曲肽組6只死亡，存活率60%；聯(lián)合組3只死亡，存活率80%；烏司他丁組5只死亡，存活率66.7%。其中聯(lián)合組與ANP組24 h存活率的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0302)。

2．血清PLA2、TNF-α、IL-6水平及腦組織含水量、TNF-α和IL-6 mRNA表達量：各實驗組6、24 h時血清PLA2、TNF-α、IL-6水平，腦組織含水量，TNF-α、IL-6 mRNA表達量均較同時間點對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。然而，各實驗組6 h點的各指標差異無統(tǒng)計學意義，而24 h時舒血寧組、奧曲肽組、聯(lián)合組、烏司他丁組各指標均較ANP組顯著下降，其中聯(lián)合組又較舒血寧組、奧曲肽組、烏司他丁組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1，圖1)。

表1 各組各項檢測指標比較

3．胰腺病理、腦組織病理及超微結(jié)構(gòu)變化：ANP組6 h時鏡下見胰腺腺泡水腫，脂肪液化，間質(zhì)顯著增寬，小葉間隙增大，炎癥細胞浸潤，胰腺局灶或片狀出血壞死，24 h時胰腺破壞更嚴重，大量腺泡消失，出血壞死區(qū)域擴大，殘存部分小葉組織(圖2)。6 h時鏡下見腦組織內(nèi)多處神經(jīng)元細胞水腫，氣球樣變，小血管和毛細血管充血，多灶性毛細管擴張及出血，血管周圍水腫，間質(zhì)炎癥細胞浸潤，微血管內(nèi)白細胞聚集及附壁，24 h時損傷更明顯(圖3)；透射電鏡下見腦神經(jīng)元的染色質(zhì)邊集，核仁消失，胞質(zhì)水腫，細胞內(nèi)容減少，線粒體腫脹，空泡變性，核膜破裂，間質(zhì)水腫和程度不等的脫髓鞘改變,24h時的病理改變更明顯(圖4、5)。

討論本研究結(jié)果顯示，ANP組6 h時胰腺組織及腦組織均出現(xiàn)病理損傷，腦組織含水量增加，提示存在腦損傷，表明ANP并發(fā)腦損傷的模型成功建立。

圖1 6、24 h時ANP組(1,2)、舒血寧組(3,4)、奧曲肽組(5，6)、聯(lián)合組(7,8)、烏司他丁組(9,10)、對照組(11,12)大鼠腦組織TNF-α、IL-6 mRNA的表達

圖2 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠胰腺組織病理改變(HE ×400)

圖3 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠腦組織病理改變(HE ×200)

圖4 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)改變(×10000)

圖5 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)改變(×15000)

文獻報道[6-10]，PLA2、TNF-α及IL-6等因子與ANP相關性腦損傷密切相關。本研究結(jié)果顯示，ANP組大鼠血清PLA2、TNF-α、IL-6水平、腦組織TNF-α、IL-6 mRNA表達量隨著時間的延長均逐漸增加，提示PLA2、TNF-α及IL-6均參與ANP相關性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展，與文獻報道的結(jié)果一致。

舒血寧注射液是第四代的銀杏葉提取物，主要有效成分為黃酮苷類和萜烯內(nèi)酯類活性物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理證明，舒血寧注射液能減輕全身炎癥反應綜合征(SIRS)時多器官的缺血再灌注損傷，清除自由基、拮抗血小板活化因子、抑制白細胞活化，減輕炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展，起到保護多臟器功能的作用[11]。奧曲肽是一種人工合成的八肽環(huán)狀化合物，具有與天然內(nèi)源性生長抑素類似的作用，但作用較強且持久，半衰期較天然生長抑素長30倍。奧曲肽具有抑制胰腺外分泌，減少胰酶含量；松弛Oddi括約肌，保持胰液引流通暢；抑制細胞因子的生成和炎癥介質(zhì)的釋放，并通過刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)而減輕內(nèi)毒素血癥，抑制炎癥反應等作用[12]。本研究結(jié)果顯示，舒血寧組及奧曲肽組與陽性對照的烏司他丁組一樣，均能降低ANP大鼠血清PLA2、TNF-α、IL-6水平、腦組織含水量及TNF-α、IL-6 mRNA表達量，減輕胰腺及腦組織的病理損傷。聯(lián)合應用舒血寧及奧曲肽的作用較單獨用藥的作用更顯著，值得在臨床進一步推廣應用。

參 考 文 獻

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