唐曉琳,鄭 捷,楊永秀

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000; 2.甘肅省第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，蘭州 730020; 3.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)院婦產(chǎn)科，蘭州 730000)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女的生命健康與生活質(zhì)量。近40年來，宮頸細(xì)胞學(xué)篩查法的普遍應(yīng)用，使得宮頸癌的發(fā)生率及死亡率明顯降低，但鑒于其有假陰性等局限性，可能造成宮頸癌的漏診、誤診等，故可靠的生物性腫瘤標(biāo)記物對宮頸癌的診斷更重要。B細(xì)胞特異的莫洛尼白血病毒插入位點1基因(B-cell specific moloney murine leukemiavirus insertionsite 1，Bmi-1)是一種癌基因，具有調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新和細(xì)胞增殖的作用[1]。目前，Honig等[2]研究發(fā)現(xiàn)Bmi- 1 在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌和乳腺癌等婦科腫瘤中高度表達(dá)，推斷Bmi-1與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。增殖細(xì)胞核抗原( proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 又稱周期蛋白, 其合成與表達(dá)和細(xì)胞增殖周期密切相關(guān),是判斷細(xì)胞增殖活性可靠指標(biāo)[3]。本實驗采用免疫組化SP法檢測Bmi-1和PNCA在宮頸不同病變中的表達(dá)情況，探討兩者在宮頸癌變過程中的意義及相互作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所用病例標(biāo)本搜集甘肅省第三人民醫(yī)院病理科和蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)院病理科2011-2013年度已被病理證實的宮頸組織蠟塊，其中宮頸正常組(10例)、CIN I組(15例)、CIN II-III組(21例)及宮頸鱗癌組(30例)，年齡26～61歲，平均43.5歲(低于40歲的13例，高于40歲的17例)，且各標(biāo)本均未做化學(xué)、免疫及放射治療。臨床分期(按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO標(biāo)準(zhǔn)分期):I-II期 15例,III-IV期 15例；病理分級：高分化鱗癌10例，中分化鱗癌9例，低分化鱗癌11例；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移12例，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移18例。

1.2 試劑 鼠抗人 Bmi-1 單克隆抗體、鼠抗人 PCNA 單克隆抗體、羊抗鼠IgG、 S-P試劑盒及DAB顯色劑均購自購于福州邁新公司。免疫組化SP法嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行操作，用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替第一抗體作陰性對照。其中Bmi-1和PNCA的工作濃度均為1∶50。

1.3 檢測標(biāo)準(zhǔn) Bmi-1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì), 呈棕黃色(見圖1～3)。PNCA陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色(見圖4～6)?？瞻钻幮詫φ盏募?xì)胞不顯色。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色輕度判斷結(jié)果：著色強度：無色(-)為0分、淺黃色(+)為1分、黃色(++)為2分、棕色及深棕色 (+++)定為3分；陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。兩項相加后分4級：0～1分為(-)，2分為(+)，3～4分為(++)，>5分為(+++)。

圖1 Bmi-1在 CIN I中的陽性表達(dá)(SP法,400×)

圖2 Bmi-1在 CIN III中的陽性表達(dá)(SP法,200×)

圖3 Bmi-1在宮頸癌中的陽性表達(dá)(SP法,400×)

圖4 PCNA在 CIN I中的陽性表達(dá)(SP法,200×)

圖5 PCNA在 CIN III中的陽性表達(dá)(SP法,400×)

圖6 PCNA在宮頸癌中的陽性表達(dá) (SP法,400×)

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，率的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗，相關(guān)性檢驗采用Spearman秩相關(guān)性分析。以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bmi-1的表達(dá) Bmi-1的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì), 呈棕黃色。 Bmi-1在宮頸正常組，CIN I組，CIN II-III組及宮頸癌組中的陽性表達(dá)率逐次呈遞增趨勢，分別為：0%、13.3%、42.9%、66.7%。四組組間比較，總P<0.05。宮頸癌組陽性表達(dá)率比宮頸正常組，CIN I組及CIN II-III組高。其中正常組與CIN I組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);其余各組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05, 數(shù)據(jù)見表1)。

表1 Bmi-1在宮頸不同病變中的表達(dá)情況 (n,%)

2.2 Bmi-1與臨床分期相關(guān)性 Bmi-1在宮頸癌中的表達(dá)與臨床分期相關(guān)。I-II期的陽性表達(dá)率低于III-IV期的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與病理分期和年齡無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 Bmi-1與宮頸癌臨床病理關(guān)系

2.3 PCNA的表達(dá) PCNA在宮頸正常組、CIN I組、CINⅡ-Ⅲ組及宮頸癌組的陽性表達(dá)率分別為10.0%、 46.7%、85.7%、96.7%。宮頸癌組比正常宮頸組、CIN I組及CINⅡ-Ⅲ組陽性表達(dá)率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中各組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 PCNA在宮頸不同病變中的表達(dá)情況 (n,%)

2.4 PCNA陽性表達(dá)率相關(guān)性 PCNA表達(dá)與臨床分期、病理分級和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。III-IV期的陽性表達(dá)率高于I-II期的陽性表達(dá)率(P<0.05)；低分化和中分化的陽性表達(dá)率高于高分化組(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(P<0.05)，但與年齡無關(guān)(P>0.05)(表4)。

表4 Bmi-1與宮頸癌臨床病理關(guān)系

2.5 Bmi-1和PCNA在宮頸癌上的相關(guān)性 根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，在宮頸癌中，Bmi-1和PCNA的表達(dá)無相關(guān)性。數(shù)據(jù)結(jié)果r<0.001，P=1.000(表5)。

表5 Bmi-1和PCNA在宮頸癌中的表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

近年來，宮頸癌的發(fā)生率和死亡率雖明顯降低，但其的發(fā)病率卻呈年輕化趨勢，且以中晚期患者為多, 預(yù)后差[4]。而宮頸癌發(fā)生的原因除了與人乳頭狀瘤病毒感染、多產(chǎn)、初產(chǎn)年齡、性行為、經(jīng)濟(jì)狀況、吸煙、長期使用避孕藥等因素有關(guān)外[5]，還可能與腫瘤相關(guān)基因有密切關(guān)系。

人類Bmi-1基因定位于第 10 號染色體短臂1區(qū)3帶(10p13)，含 10 個外顯子和 10個內(nèi)含子，外顯子編碼含 326 個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為36.9KU[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Bim-1與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)，其在腫瘤發(fā)生中的作用機制是由于它可負(fù)性調(diào)P16INK4a和P19arf這兩種抑癌基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和衰老，而其在腫瘤中高表達(dá)可能與其上調(diào)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的轉(zhuǎn)錄，致使端粒酶活性增高，從而阻止細(xì)胞的衰老，導(dǎo)致細(xì)胞“永生化”[7-8]。本次研究結(jié)果顯示：Bim-1的陽性表達(dá)率在宮頸病變中依次呈遞增趨勢，宮頸癌組陽性表達(dá)率明顯比其他組陽性表達(dá)率高，宮頸正常組無陽性表達(dá)，且CIN II-III組明顯比CIN I組陽性表達(dá)率高(P<0.05)。從而可以為上述解釋提供參考依據(jù)。

另外,III-IV期宮頸癌Bmi-1的陽性表達(dá)率明顯高于I-II期的陽性表達(dá)率(P<0.05)；且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Bmi-1陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率(P<0.05)。說明Bim-1陽性表達(dá)率的多少除了可提示宮頸病變的嚴(yán)重程度和級別外，還可提示宮頸癌的浸潤程度與預(yù)后等情況。

PCNA參與真核細(xì)胞 DNA合成, 隨細(xì)胞周期的變化而變化, 是一種評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的常用指標(biāo)[9]。本文結(jié)果顯示：PCNA在宮頸正常組、CIN I組、CINⅡ-Ⅲ組及宮頸癌組的陽性表達(dá)率明顯呈遞增趨勢(P<0.05),且陽性細(xì)胞表達(dá)百分比顯著高于同組Bmi-1的陽性細(xì)胞百分比；而PCNA在宮頸癌中的陽性表達(dá)率與臨床分期、病理分級和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)， III-IV期宮頸癌PCNA的陽性表達(dá)率亦明顯高于I-II期的陽性表達(dá)率(P<0.05)；低分化和中分化的PCNA陽性表達(dá)率明顯高于高分化組(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PCNA陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率(P<0.05)。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展由于多因素，多基因共同作用的結(jié)果。研究結(jié)果提示：Bim-1和PCNA在宮頸病變中的表達(dá)情況及與宮頸癌臨床特征的關(guān)系中表達(dá)趨勢基本一致，但兩者在宮頸癌中的表達(dá)率卻無相關(guān)性(P>0.05)。這也提示我們：Bim-1與PCNA在腫瘤形成過程中可能是獨立參與的，原因可能是由于它們不同的作用機制造成的，更深層次的研究兩者在腫瘤形成過程中的作用機制及其作用靶點，將是一個新的研究方向。

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