付錦楠，張文萌，孫立新，郭建軍，何順華，王曉玲

(1.江西省科學(xué)院微生物研究所，330096，南昌;2.臨沂市食品藥品檢驗檢測中心，276000，山東，臨沂;3.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，110016，沈陽;4.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，201203，上海)

0 引言

地黃為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鮮或干燥塊根[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。地黃在藥材上分為鮮地黃、生地黃。鮮地黃性寒，味甘苦，能清熱生津，涼血止血。生地黃性寒，味甘，能清熱涼血，養(yǎng)陰生津。地黃是臨床常用的中藥材，近年來國內(nèi)外對地黃的化學(xué)成分和藥理作用進行了大量深入的研究，證實地黃除了對血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)有作用外，還具有抵制胃酸分泌、改善腎功能以及保肝作用等[2]。然而由于地黃中化學(xué)成分復(fù)雜多樣，這些藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)是什么，到目前為止并不清楚。

現(xiàn)代藥理研究表明[3]，中藥發(fā)揮作用的一個重要步驟是活性成分與靶細胞膜、細胞內(nèi)特異性酶或受體結(jié)合。大多數(shù)藥物需要通過細胞膜產(chǎn)生藥理活性，其活性與細胞膜親和性和通透性密切相關(guān)，因而采用細胞作為篩選工具來探尋中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究成為可能。由于不同種類細胞膜上具有不同種類受體、離子通道、酶等效應(yīng)靶點，因而可以針對不同藥理效應(yīng)指標(biāo)選擇特定的體外細胞作為篩選工具。這使得基于細胞的細胞膜色譜技術(shù)，成為探索中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要手段之一[3～5]。細胞膜色譜技術(shù)分為細胞膜生物親和色譜技術(shù)與細胞膜固相色譜技術(shù)[4]。細胞膜固相色譜法是直接以活性細胞為分離載體，以中藥提取物為研究對象，依據(jù)提取物中的成分與細胞是否具有特異親和能力而進行分離，采用色譜比較中藥提取物與細胞結(jié)合前后中藥提取物色譜圖的變化，分析細胞破碎液中與活性細胞相結(jié)合的成分，應(yīng)用HPLC或LC-MS等色譜技術(shù)進行鑒定，從復(fù)雜的中藥體系中篩選出與活性細胞相互作用的成分。該方法與細胞膜生物親合色譜技術(shù)相比，能保持細胞膜的完整性，操作簡便易行，已用于多種單味中藥以及復(fù)方中活性成分的篩選[5]。應(yīng)用肝細胞建立的細胞膜色譜也已從梔子[6]以及當(dāng)歸補血湯[7]中鑒別了多個活性成分。

現(xiàn)已證實地黃具有保肝作用[2]，但其保肝的活性成分未見有研究報道。筆者前期對地黃的化學(xué)成分及質(zhì)量控制方法進行了研究[8，9]，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用原代肝細胞建立肝細胞膜色譜法，首次從地黃中鑒別出了能與肝細胞作用的2個活性成分:麥角甾苷和吉奧諾苷B1，并進一步證實其對H2O2誘導(dǎo)肝細胞損傷具有一定的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

生地黃藥材購于上海，由上海中醫(yī)藥大學(xué)崔亞軍副教授鑒定為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosaLibosch.)的干燥塊根;正常人肝臟組織細胞HL-7702購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。對照品:麥角甾苷購于成都曼思特生物科技有限公司(HPLC純度大于98%);異麥角甾苷和松果菊苷購于上海順勃生物科技有限公司(HPLC純度大于98%);吉奧諾苷B1和馬替諾苷為自制(HPLC純度大于99%)。Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)，日本同仁化學(xué)研究所;胎牛血清，天津TBD公司;RPMI-1640培養(yǎng)基干粉以及胰蛋白酶，美國Gibco公司;二甲基亞砜(DMSO)、過氧化氫等購自國藥集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 地黃提取液指紋圖譜的HPLC測定

1)供試液的制備。取生地黃藥材用50%甲醇加熱回流提取3次，每次1 h，紗布過濾，濃縮至每毫升含1.0 g生藥。放冷，離心，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，供HPLC分析。

2)對照溶液制備。采用麥角甾苷(acteoside)、異麥角甾苷(isoacteoside)、松果菊苷(echinacoside)、吉奧諾苷B1(Jionoside B1)和馬替諾苷(martynoside)為參照物，精密稱定適量，用50%甲醇水溶液溶解，配制成混合對照品溶液，供HPLC分析。

3)地黃提取液指紋圖譜的建立。色譜條件:色譜柱，Dikma Platisil ODS C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相，A(水溶液)-B(乙腈);梯度洗脫程序，0－10 min(0%B)，10－15 min(0% ～1%B)，15－45 min(1% ～9%B)，45－80 min(9% ～25%B)，80 －90 min(25% ～90%B)，90－100 min(90%B);流速:1 mL/min;檢測波長，330 nm;柱溫，30 ℃;進樣量，20 μL。

1.2.2 肝細胞膜色譜鑒別地黃提取液中的活性成分

1)HL-7702肝細胞的獲取及培養(yǎng)。HL-7702細胞來源于人正常肝組織，具有貼壁生長、接觸抑制、密度依賴性、生長速度穩(wěn)定等生物學(xué)特性。鏡下觀察細胞形態(tài)為多邊形，相互連接成島狀。肝細胞在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2)地黃效應(yīng)成分與肝細胞的結(jié)合。取地黃提取液0.1 mL，以 RPMI1640液稀釋至5 mL，配制成含生藥20.0 mg/mL的地黃培養(yǎng)液，加入到肝細胞中;置37℃，5%CO2，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。

3)未結(jié)合成分的洗脫。將培養(yǎng)后的細胞加入10 mL PBS緩沖液并用吸管輕輕吹打，洗滌，離心(1 000 r/min，10 min)，取上清液，如上操作直至HPLC檢測洗滌液無保留峰。

4)肝細胞結(jié)合地黃成分的解離。將洗滌后的肝細胞中加入pH4的D-Hanks緩沖液2 mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，使細胞上的靶點失活，將結(jié)合的藥物釋放出來。離心(1000 r/min，10 min)，得上清解離液。

5)上清解離液的色譜分析。將所得最后一次洗滌液及上清解離液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，凍干，殘渣用200 μL 50%甲醇-水復(fù)溶，渦旋均勻，離心(12 000 r/min，10 min)。吸取上清液 20 μL進樣。

1.2.3 麥角甾苷和吉奧諾苷B1對H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷的保護作用 采用HL-7702肝細胞，實驗時以5×104cells/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后加藥。同時設(shè)陰性對照組(只接種細胞作為正常對照)、空白組(不接種細胞只加等量的培養(yǎng)液以消除背景)、模型組、用藥組(保護組和毒性組)。每組均設(shè)5復(fù)孔，用藥組(保護組和毒性組)每孔加藥75 μL，其他組平行加入培養(yǎng)液相同體積。培養(yǎng)22 h后，保護組和模型組每孔加入25 μL H2O2(終濃度為0.8 mM)繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，所有組同時加入10 μL CCK-8試劑，37℃溫育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測OD值，計算細胞存活情況。

細胞存活率(%)=(實驗組OD值－空白組OD值)/(對照組OD值－空白組OD值)×100%

統(tǒng)計學(xué)分析:數(shù)據(jù)以均數(shù)表示，每組設(shè)5復(fù)孔，組間比較采用 T檢驗(T-TEST)，P≤0.05為有組間數(shù)據(jù)差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果分析

2.1 地黃提取液HPLC指紋圖譜

平行制備3份地黃供試品，選擇樣品共有的、保留時間及峰面積相對穩(wěn)定的22個色譜峰作為地黃指紋圖譜的共有峰，地黃的HPLC指紋圖譜和混合對照品圖譜見圖1，將混合對照品峰作為參照物峰，記錄各共有峰的相對保留時間。

圖1 地黃提取液指紋圖譜

圖2 5種混合對照品圖譜

2.2 肝細胞膜色譜鑒別地黃提取液中的活性成分

最后一次洗滌液(A)、D-Hanks空白對照液(B)、空白對照解離液(C)、地黃提取液作用于肝細胞后的解離液(D)與地黃提取液指紋圖譜(E)的HPLC對照圖。由圖3可見，地黃提取液作用于肝細胞后的解離液(D)可檢測到6個色譜峰，與最后一次洗滌液(A)和空白對照液(B)對比，其中峰a在D-Hanks空白液(B)里面出現(xiàn)，故為D-Hanks里物質(zhì)，峰c和峰f在空白對照解離液(C)里均出現(xiàn)，故不是地黃提取液與肝細胞結(jié)合的成分;與空白對照解離液(C)對比，僅峰b、峰d和峰e在地黃提取液作用于肝細胞后的解離液(D)中存在。與地黃提取液指紋圖譜(E)對照，表明峰b、峰d和峰e這3個峰是地黃提取液中與肝細胞結(jié)合的成分，分別對應(yīng)于地黃提取液指紋圖譜(E)中的峰10、11和12，其中峰11為麥角甾苷，峰12為吉奧諾皂苷B1，因而地黃提取液作用于肝細胞后的解離液(D)中的峰d為麥角甾苷，峰e為吉奧諾皂苷B1。而地黃提取液作用于肝細胞后的解離液(D)中峰b(相當(dāng)于地黃提取液指紋圖譜中的峰10)還有待進一步鑒定。

圖3 最后一次洗滌液(A)，D-Hanks空白對照液(B)，空白對照解離液(C)，地黃提取液作用于肝細胞后的解離液(D)，地黃提取液指紋圖譜(E)的HPLC對照圖

2.3 地黃中活性成分對H2O2誘導(dǎo)肝細胞損傷的保護作用

H2O2是一種強氧化劑，是經(jīng)典的誘導(dǎo)細胞發(fā)生氧化損傷的試劑，在多種組織損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。H2O2作用肝細胞后，它能被細胞色素P-450代謝分解，生成·OH自由基，進而攻擊細胞生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，大量消耗細胞內(nèi)源性還原物質(zhì)GSH，增加過氧化產(chǎn)物MDA的積累，最終導(dǎo)致細胞死亡[10]。CCK-8是一種用于測定細胞增殖或毒性試驗中活細胞數(shù)目的一種高靈敏度、無放射性的比色檢測法[11]。本文采用CCK-8比色法進行細胞毒性檢測，探討地黃中與肝細胞結(jié)合的化學(xué)成分麥角甾苷和吉奧諾苷B1對H2O2誘導(dǎo)肝細胞損傷的保護作用。結(jié)果顯示，麥角甾苷(acteoside)對H2O2誘導(dǎo)下的人正常HL-7702肝細胞損傷都有一定的保護作用且無毒性，這與文獻報道[12]結(jié)果基本一致;吉奧諾皂苷B1(jionoside B1)在低濃度下對肝損傷有一定的保護作用，高濃度下對肝損傷保護作用逐漸減弱且出現(xiàn)一定細胞毒性，吉奧諾皂苷B1為首次報道其在低濃度下對H2O2誘導(dǎo)下的人正常HL-7702肝細胞損傷的有一定的保護作用，實驗結(jié)果見表1、表2。

表1 麥角甾苷和吉奧諾苷B1對H2O2誘導(dǎo)的肝損傷有保護作用(χ±s，n=5)

3 討論

地黃是臨床常用的中藥材，近年來國內(nèi)外對地黃的化學(xué)成分和藥理作用進行了大量深入的研究。然而由于地黃中化學(xué)成分復(fù)雜多樣，其藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)并不清楚。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究是近年來中藥研究的熱點領(lǐng)域之一，本文以HL-7702肝細胞構(gòu)建肝細胞膜色譜，并運用到地黃抗化學(xué)性肝損傷的活性成分研究。首次發(fā)現(xiàn)地黃中的麥角甾苷和吉奧諾苷B1能與肝細胞結(jié)合，進一步證實這2個化合物對H2O2誘導(dǎo)肝細胞損傷具有一定的保護作用，是地黃中抗化學(xué)性肝損傷的活性成分。

表2 麥角甾苷和吉奧諾苷B1對HL-7702的細胞毒性(χ±s，n=5)

在肝細胞膜色譜研究中還有一些色譜峰未能鑒定，有待進一步的實驗證實;地黃中能與肝細胞結(jié)合的效應(yīng)成分如麥角甾苷和吉奧諾苷B1，它們結(jié)合于肝細胞的什么靶點，對肝細胞損傷保護作用的作用機制如何，也還有待進一步研究。另外，和所有的離體實驗一樣，肝細胞膜色譜法也有其局限性，對于在體內(nèi)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化后發(fā)生作用的、不直接作用于肝細胞的一些效應(yīng)成分無法追蹤。

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