黃江麗，王東升，張志紅，張國華，田曉娟，譚胤靜，付 明，丁建南

(江西省科學院生物資源研究所，330096,南昌)

體外產氣法研究植物精油對水牛瘤胃發(fā)酵和甲烷生成的影響

黃江麗，王東升，張志紅，張國華，田曉娟，譚胤靜，付 明，丁建南*

(江西省科學院生物資源研究所，330096,南昌)

為探討植物精油對水牛瘤胃體外發(fā)酵的影響，本研究采用體外產氣法初步研究了不同植物油對水牛瘤胃發(fā)酵過程中甲烷和二氧化碳生成及微生物蛋白和pH的影響。與對照組相比結果表明:1)在相同添加濃度下，桂皮油在發(fā)酵過程中基本抑制了甲烷生成(P<0.05)，也顯著降低了二氧化碳產量(P<0.05)，微生物蛋白含量減少了15%;2)薄荷油在發(fā)酵12 h、24 h均顯著抑制甲烷生成(P<0.05)，對二氧化碳產量稍有降低，但差異不顯著；在發(fā)酵36 h，抑制甲烷效果不明顯，二氧化碳反而顯著降低(P<0.05)。微生物蛋白含量則減少了12.8%;3)生姜油和丁香油的抑制甲烷效果不明顯，只在發(fā)酵12 h，有部分降甲烷效果，之后反而促進了甲烷生成;4)5種精油中，只有辣椒油處理組發(fā)酵液pH顯著降低，其它對pH值影響不大，但辣椒油無抑制甲烷效果。

植物精油；瘤胃；體外產氣法；甲烷生成

0 引言

反芻動物瘤胃內產生的甲烷是有機物發(fā)酵的必然產物。據報道，反芻動物產生甲烷會造成總能量損失2%～12%[1]。同時，甲烷是造成溫室效應的主要氣體之一。所以，抑制反芻動物甲烷的產生對經濟和環(huán)境都有重要的意義。在反芻動物中，牛體格大，采食量大，飼養(yǎng)數量多，因此所產生的甲烷的總量是不可低估的。目前，抗生素離子載體等已經成功地用于降低瘤胃中能量和蛋白質的損失。由于抗生素在乳和肉中殘留及其對人類健康影響的風險，公眾越來越重視抗生素等促生長劑在畜禽生產中使用[2]。因此，開發(fā)天然的瘤胃調控劑對提高反芻動物生產性能和保護環(huán)境均有重大意義。

植物精油是從植物中萃取的芳香物質，是植物的次生代謝產物，具有天然無耐藥性、毒副作用小等優(yōu)勢，近年來被廣泛應用于反芻動物瘤胃調控研究中。本研究通過體外產氣試驗評價不同植物精油對瘤胃甲烷產量和發(fā)酵參數的影響，旨在尋找經濟有效的瘤胃甲烷調控精油種類，為進一步研制反芻家畜降甲烷微生態(tài)生長促進劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

天然提取的植物揮發(fā)油全部購自江西吉安盛大香料油有限公司，提取方法為水蒸汽蒸餾法，4 ℃冰箱保存。莫能菌素(有效成分含量為40%)購自江西南昌獸醫(yī)防疫站。

1.2體外瘤胃發(fā)酵實驗設計

實驗設負對照組(未添加組)和正對照組(添加60 mg/L莫能菌素組)。各精油濃度統(tǒng)一用量為500 mg/L,每個處理設5個重復。分別在12 h、24 h、36 h測定CH4和CO2含量，發(fā)酵結束后測定發(fā)酵液pH值，并把發(fā)酵液保存在4 ℃冰箱，用于微生物蛋白含量測定。

1.3體外培養(yǎng)

采用Maur icio[3]等的壓力讀取式體外產氣系統(tǒng)進行體外瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)。瘤胃液取自江西南昌縣小蘭工業(yè)園屠宰場。在試驗當天晨飼前抽取水牛瘤胃液，4層紗布過濾至預熱處理后的收集瓶，39 ℃水浴保溫,沖入CO2厭氧備用。在體外培養(yǎng)前, 將發(fā)酵底物(稻草粉、玉米粉和黃豆粉按照2:1:0.3比例)及相應量的植物精油預先稱入100 mL產氣瓶中，然后準確抽取40 mL人工唾液。將產氣瓶用CO2飽和后密封并于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱內過夜后吸取10 mL瘤胃液于產氣瓶中，混勻，產氣瓶置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。厭氧人工瘤胃緩沖液的配制按Menke[4]等的方法配制, 配方如下：在520.2 mL蒸餾水中依次加入208.1 mL緩沖溶液( B) 、208.11 mL常量元素溶液(C)、0.1 mL微量元素溶液(A)、1.0 mL刃天青指示劑(D)，62.4 mL還原劑溶液(E)，通入CO2氣體使其飽和，直至溶液由淡藍色轉變?yōu)闊o色。

A，微量元素溶液：13.2 g CaCl2·2H2O+10.0 g MnCl2·4H2O+1.0 g CoCl2·6H2O+8.0 g FeCl3·6H2O,加蒸餾水溶解,定容至100 mL；

B，緩沖溶液：4.0 g NH4HCO3+35.0 g NaHCO3,加蒸餾水溶解定容至1 000 mL；

C，常量元素溶液：9.45 g Na2HPO4·12H2O+6.20 g KH2PO4+0.60 g MgSO4·7H2O，加蒸餾水溶解，定容至1 000 mL；

D，0.1%(W/V) 的刃天青溶液，100 mg刃天青溶解于100 mL蒸餾水；

E，還原劑溶液(現配現用)：625 mg Na2S·9H2O+4.0 mL 1 mol/L NaOH+95 mL蒸餾水。

1.4測定指標及方法

CH4和CO2含量測定采用Gasboard 3 200L便攜紅外沼氣分析儀(武漢四方光電科技有限公司)，發(fā)酵液pH值用梅特勒-托利多酸度計直接測定，菌體蛋白的測定采用Makkar和Becker[5](1999),Zinn和Owens[6](1986)的試驗原理和試驗方法，用嘌呤法測定體外菌體蛋白產量。

1.5統(tǒng)計分析

試驗數據采用EXCEL2003整理，運用SPSS18統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1植物精油對甲烷和二氧化碳的影響

植物精油對甲烷影響總結于表1。表1是發(fā)酵時間12 h、24 h、36 h各處理的甲烷變化情況。從表1可以看出，發(fā)酵12 h時，桂皮油完全抑制了甲烷生成，比正對照組即莫能菌素組效果顯著(P<0.05)。與負對照比，抑制甲烷效果好的依次還有薄荷油(P<0.05)、丁香油、生姜油，但均沒有正對照組效果顯著。辣椒油則稍微促進甲烷的生成。發(fā)酵24 h時，桂皮油處理組依然不產甲烷，說明桂皮油完全抑制了甲烷生成。而生姜油、丁香油則開始促進甲烷生成。薄荷油處理組產甲烷量與12 h一致，但效果超過了正對照組，說明抑制效果穩(wěn)定。發(fā)酵36 h時，桂皮油處理組開始產少量甲烷，而其它處理組產甲烷量均降低。與正負對照組比，桂皮油抑制效果顯著，薄荷油則稍微比負對照組產甲烷量少，而辣椒油、生姜油和丁香油則均比負對照組產甲烷量稍高。

表1 不同時間點各處理的CH4(%)變化情況

*均值差值在0.05級別上較顯著。

綜上，桂皮油在發(fā)酵過程中完全抑制了甲烷生成，發(fā)酵36 h前，產氣量均為0，發(fā)酵到36 h時才產極少量的氣。薄荷油抑制甲烷效果顯著，只是隨著發(fā)酵時間延長，薄荷油的消耗，抑制作用也相應降低。生姜油和丁香油則只在發(fā)酵12 h時有抑制效果。圖1是發(fā)酵12 h時各處理的產甲烷量均值圖。從圖1可明顯看出桂皮油的抑制效果，其它除辣椒油組外各處理組均不同程度地抑制了甲烷生成。

表2為植物精油對CO2產量的影響。從表2中可以看出，發(fā)酵12 h和24 h時，與對照相比只有桂皮油處理組顯著降低了CO2產量(P<0.05)，可能與其完全抑制甲烷產生，也抑制其它微生物生長有關。發(fā)酵36 h時，薄荷油、丁香油處理組顯著降低CO2產量(P<0.05)，而桂皮油處理組反而差異不顯著，可能隨著桂皮油的消耗，除產甲烷菌外利于發(fā)酵的微生物差不多恢復正常水平。

圖1 發(fā)酵12 h時各處理產甲烷均值圖

表2 不同時間點各處理的CO2(%)變化情況

*均值差值在0.05級別上較顯著。

2.2植物精油對發(fā)酵液MCP和pH的影響

pH是一項反映瘤胃內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的指標。本實驗取發(fā)酵36 h后的發(fā)酵液測定pH值和MCP含量。圖2為植物精油對發(fā)酵液MCP含量影響圖，植物精油對發(fā)酵體系pH的影響總結于表3。由圖2可以看出，各處理MCP含量都低于正負對照組，與對正對照組相比以生姜油含量最低(降低20%)。其次為桂皮油(降低15%)，辣椒油和薄荷油(降低12.8%)，丁香油(降低10%)。其中辣椒油、薄荷油、丁香油處理組的MCP含量接近正對照組。而根據表3，與正對照比較，只有辣椒油處理組pH差異顯著(P<0.05)，其它各處理pH差異不顯著。

圖2 植物精油對發(fā)酵液MCP的影響

表3各組pH變化情況

CK桂皮油辣椒油生姜油薄荷油丁香油莫發(fā)酵后6．86±0．0176．88±0．0106．81±0．009?6．90±0．0086．90±0．0066．85±0．0026．85±0．007

*均值差值在0.05 級別上較顯著。

3 討論

在反芻動物養(yǎng)殖過程中，CO2和CH4的排放不僅造成溫室效應，而且隨CH4排放而損失的能量約占飼料總能的2%～15 %[7]。瘤胃內甲烷產生是有機物發(fā)酵的必然產物。通過抑制瘤胃發(fā)酵過程中甲烷的產生，可以提高反芻動物對能量利用效率，改善環(huán)境[8]。MCP則是反芻動物最主要的氮源供應者，能提供蛋白需要量的40%～80%，MCP合成需要各種營養(yǎng)物質的供應，包括碳水化合物、維生素、微量及常量元素等，而維持微生物生長最主要的營養(yǎng)源是能量和蛋白質。了解瘤胃MCP合成的因素對于進一步研究動物營養(yǎng)調控技術有十分重要的意義[9]。pH是一項反映瘤胃內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的指標，它受唾液分泌量、有機酸積累和日糧性質的影響。pH過高或過低對瘤胃微生物的生長、發(fā)育和發(fā)酵均產生不利影響[10]。本實驗中只有辣椒油處理組發(fā)酵液pH顯著降低，而在本實驗中，辣椒油促進了甲烷生成，所以后續(xù)實驗可以不予考慮。桂皮油、生姜油、薄荷油、丁香油處理組pH值與對照相比差別不大，說明添加一定水平的這幾種油不會改變瘤胃液pH環(huán)境。

目前，肉桂油作為一種天然瘤胃調控劑研究得比較多[10-11],而對于桂皮油的研究較少。本實驗中，桂皮油在發(fā)酵過程中基本抑制了甲烷產生，在發(fā)酵12 h、24 h均也顯著抑制了CO2生成，這在相當程度上減少了對環(huán)境的破壞與飼料的能量損失。但桂皮油處理的MCP含量也有所降低，因此后續(xù)研究應該以現有的添加水平為準，適當降低桂皮油添加水平，以期找到一個既能有效降低甲烷又能促進瘤胃微生物發(fā)酵的適宜水平。薄荷油則抑制甲烷效果顯著，只是隨著發(fā)酵時間延長，薄荷油的消耗，抑制作用也相應降低，這與Agarwal N[12]等的報道一致。而且薄荷油處理也降低了CO2生成，MCP含量也未受多大影響，故可以考慮其作為瘤胃調控劑成分進一步研究。生姜油和丁香油的抑制甲烷效果不明顯，只在發(fā)酵12 h時，有部分降甲烷效果，之后反而促進了甲烷生成。這可能是與這2種油中能抑制甲烷的有效成分少，消耗快，而其中的其它成分又作為營養(yǎng)為產甲烷菌利用所致。只不過丁香油抑制甲烷效果又比生姜油稍好，后續(xù)促進產甲烷效果也沒生姜油明顯。其處理的MCP含量也明顯高于生姜油處理組。丁香油的抑制甲烷效果與金恩望等研究結果一致，對瘤胃發(fā)酵基本無調節(jié)作用。

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EffectsofEssentialOilonBuffalo′sRumenFermentationandMethanogenesisinVitroGasProduction

HUANG Jiangli,WANG Dongsheng,ZHANG Zhihong,ZHANG Guohua,TIAN Xiaojuan, TAN Yinjing,FU Ming,DING Jiannan*

(Institute of Biological Resources,Jiangxi Academy of Sciences,330096,Nanchang,PRC)

An in vitro gas production trial was conducted to study the effects of different essential oil on subsequent 36 h buffalo′s rumen fermentation and methanogenesis.Compared to the control,the results showed that,(1)Cinnamon oil almost completely inhibited the methanogenesis (P<0.05),also significantly reduced the carbon dioxide output (P<0.05),and the microbial crude protein (MCP) was reduced by 15%.(2)Peppermint oil were significantly inhibited the methanogenesis at 12 h and 24 h of fermentation (P<0.05),but there was no effect on the production of carbon dioxide;at 36 h of fermentation,the effect of inhibiting methanogenes is not obvious,but the carbon dioxide output was significantly reduced.the MCP was reduced by 12.8%.(3)ginger oil and clove oil′s inhibition of methanogenesis is not obvious,only at the 12 h of fermentation has a little effect,but it can promote the methanogenesis after that.(4)among five kind of essential oils,only the chili oil reduced the pH significantly (P<0.05),but it also promoted the methanogenesis.

essential oil;in vitro gas production;rumen fermentation;methanogenesis

2014-03-26;

2014-05-06

黃江麗(1980-)，女，湖南資興人，碩士研究生，助理研究員，主要從事微生物生態(tài)學研究工作。

江西省科技支撐計劃項目“反芻家畜降甲烷微生態(tài)制劑研究”；江西省科學院普惠項目“瘤胃甲烷調控劑的篩選和優(yōu)化組合”。

*通訊作者：丁建南(1955-)，男，研究員，研究方向為微生物生態(tài)學。Email:jiannanding@yahoo.com.cn。

1001-3679(2014)03-0328-05

S823；S816.7

A