張子方 陳彥龍 張文芬 王 菲 杜慧芳 導(dǎo)師：張書勝

（鄭州大學(xué)化學(xué)系，河南 鄭州 450001）

四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪鍵合硅膠固相萃取串聯(lián)高效液相色譜法測定水果中7種植物生長調(diào)節(jié)劑

張子方 陳彥龍 張文芬 王 菲 杜慧芳 導(dǎo)師：張書勝

（鄭州大學(xué)化學(xué)系，河南 鄭州 450001）

本文建立了四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪鍵合硅膠（NCS）固相萃取串聯(lián)高效液相色譜法（SPE-HPLC）測定水果中噻苯隆、2-（1-萘基）乙酸（α-萘乙酸）、對氯苯氧乙酸（防落素）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）、1-（2-氯-4-吡啶基）-3’-苯基脲（KT-30）七種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的新方法。實驗采用自制四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪（NCS）作為固相萃取吸附劑提取、凈化樣品溶液，采用優(yōu)化的W atersXBridge C18色譜分離柱和甲醇：0．1%磷酸溶液（55：45，v/v）流動相，在檢測波長210 nm時，在0．3-200μg/m L濃度范圍內(nèi)七種植物生長調(diào)節(jié)劑線性相關(guān)性較好（R 2＞0．999）。七種植物生長調(diào)節(jié)劑回收率在77．2%-98．1%之間，相對標準偏差（RSD）小于5%，檢出限在4-22 ng/m L之間。結(jié)果表明該方法具有操作簡便、快速、靈敏、準確、重復(fù)性好等優(yōu)點，可以滿足植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的快速篩查和定量分析，是一種較為理想的多種植物生長調(diào)節(jié)劑同時分離檢測的新方法。

四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪；固相萃??；高效液相色譜；植物生長調(diào)節(jié)劑

1 引言

植物生長調(diào)節(jié)劑對植物生長具有促進其根、發(fā)芽、發(fā)育、早熟、防止落花、落果、形成無子果實，或抑制其發(fā)芽、整枝脫葉等作用[1]，能顯著地提高種植效益，因此，被廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)代化的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

然而與其他農(nóng)藥一樣，植物生長調(diào)節(jié)劑也具有一定的毒性，如丁酰肼的水解產(chǎn)物二甲基聯(lián)氨就是一種潛在的致癌物[2]。長期食用有植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的水果、蔬菜等，會對人體產(chǎn)生副作用，使人體分泌紊亂，影響代謝的平衡[3]。目前，植物生長調(diào)節(jié)劑的濫用、使用不當(dāng)?shù)葘?dǎo)致的食品安全問題逐漸增多，由此引發(fā)的食品安全事故也頻繁發(fā)生[4.6]，植物生長調(diào)節(jié)劑在食品中的殘留也因此成為影響我國食品安全的主要因素之一。因此，建立食品中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的快速有效地檢測方法，對保證食品安全，促進人類健康及社會經(jīng)濟發(fā)展都具有重大的現(xiàn)實意義。

目前，對植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測方法有很多種，其中包括氣相色譜，液相色譜，氣質(zhì)聯(lián)用，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等[7-13]。但在這些檢測中，氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用在應(yīng)用中往往需要衍生化處理，以降低待測物質(zhì)的氣化溫度，相對復(fù)雜；毛細管電泳技術(shù)靈敏度高，檢測限低但重現(xiàn)性差，不利于定量分析檢測；液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是近年來發(fā)展應(yīng)用最為廣泛地檢測方法，但液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)儀器成本較高，不利于一般實驗室的普及，且基質(zhì)效應(yīng)影響嚴重，對前處理要求苛刻；然而液相色譜相對簡單，可操作性強，且成本低易于普及，僅需簡單的前處理過程，可以滿足分析需求。

植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測多伴隨復(fù)雜基質(zhì)的存在都需要經(jīng)復(fù)雜的前處理過程，目前，前處理方法主要包括加速溶劑萃?。ˋSE），液液萃?。↙LE）和固相萃取。其中ASE和LLE是較為傳統(tǒng)的處理方式，處理過程中容易造成靶標物的損失，且需要消耗大量的有毒害的有機溶劑和勞動力，因此，近年來新型的固相萃取技術(shù)成為目前常用的前處理手段。常用的萃取柱有C18柱、HLB柱等，成本較高且作用力模式單一，不利于多種植物生長調(diào)節(jié)劑的同時凈化與富集。因此，有必要發(fā)展一種新型的固相萃取材料，實現(xiàn)多種植物生長調(diào)節(jié)劑的同時富集檢測。

我們課題組前期的大量研究工作表明四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪固相萃取吸附劑（圖1，顆粒直徑為40-60um）具有多重作用力模式[14-17]，適用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量靶標物質(zhì)的富集與凈化，本文采用這種自制的杯芳烴固相萃取小柱，旨在建立多種植物生長調(diào)節(jié)劑簡單、快速、廉價、環(huán)保的同時分離檢測新方法。

圖1 NCS結(jié)構(gòu)式

2 實驗部分

2.1 儀器，材料和試劑

葡萄、西瓜、蘋果、桃子（均購置于當(dāng)?shù)爻校?-（1—萘基）乙酸（萘乙酸，含量按98%計）、對氯苯氧乙酸（防落素，含量按98%計）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，含量按98%計）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA，含量按98%計）、赤霉素（GA3，含量按98%計）、1-（2-氯-4-吡啶基）-3’-苯基脲（KT-30，含量98%計）；超純水（電阻率≥18.2MΩ·cm）；甲醇、乙腈（色譜純，美國J&TBaker公司）；磷酸（天津市科密歐科技有限公司）。Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；CP2245電子分析天平（感量：0.0001 g，德國Sartorius公司）；Milli—Q超純水儀（美國Millipore公司）；Turbo Vap II氮吹濃縮儀（美國Zymark公司）；Sigma 3-15低溫高速離心機（德國Sigma離心機公司）；KQ一700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2.2 方法

2.2.1 NCS固相萃取柱的制備。自制NCS固相萃取小柱：商品化的聚丙烯空柱管（規(guī)格為100mg/3cc，迪馬科技公司）先用水和甲醇清洗，柱管的出口端與真空泵連接并使柱管垂直，稱取100mg自制的NCS，在負壓作用下裝入柱管，柱管中填料的兩底端分別用聚丙烯篩板固定，適度振實，備用。

2.2.2 樣品處理與分析

稱取樣品2.0 g（精確到0.001 g）勻漿后置于50mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入10mL甲醇溶液，漩渦振蕩1min，在4℃下靜置過夜后超聲提取10min，2000 r/min轉(zhuǎn)速離心10min，取上層清液于30℃旋干濃縮，用水定容至1mL，后上樣至依次經(jīng)4 mL乙腈活化，4mL水平衡后的NCS（或C18）柱床，采用3mL/min的流速過固相萃取小柱。后用4mL水淋洗柱床，6mL乙腈洗脫，收集洗脫液至15mL具刻度的試管中，45℃氮吹濃縮至近干，用甲醇定容至1.0mL。溶液過0.22mm濾膜，濾液供HPLC分析。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（250×4.6mmi.d.，5μm），流動相：甲醇：0.1%磷酸水溶液（55：45，v/v），流速：0.7mL/min，進樣量：20μL，VWD紫外檢測波長：210 nm。

2.4 標準溶液的配制

萘乙酸、2，4-D、噻苯隆、6-BA、GA3、防脫落素、KT-30標準品0.02 g溶于100ml容量瓶中，逐級稀釋成2倍、5倍、25倍、125倍、625倍并繪制標準曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 固相萃取條件優(yōu)化

本實驗使用四氮雜杯［2］芳烴［2］三嗪鍵合硅膠吸附劑（NCS）對七種進行富集，并且對NCS用量、吸附容量、不同洗脫劑、洗脫劑的用量、上樣體積、樣品pH值、上樣流速等影響固相萃取效率的因素進行了優(yōu)化，最終選定條件為：100mg/3cc的固相萃取小柱，6mL的乙腈為洗脫劑，上樣流速3mL/min，上樣pH不需調(diào)整，富集效果如圖2所示。

圖2 NCS與C18固相萃取效果對比

3.2 標準曲線與檢測限

將1.4中的一級內(nèi)標儲備溶液逐級稀釋2倍、5倍、25倍、125倍、625倍并繪制標準曲線，將配制的標準工作溶液由低到高濃度進行HPLC，以各標準物質(zhì)的峰面積（Y）對相應(yīng)的濃度（X，ng/ mL）進行線性回歸分析，得到七種植物生長調(diào)節(jié)劑的工作曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)r。將各物質(zhì)最低濃度的標準工作溶液重復(fù)進樣5次，計算標準偏差，以3倍標準偏差為方法的檢出限，10倍標準偏差為定量限，結(jié)果如表1所示，在0.3-200μg/mL的線性動態(tài)范圍內(nèi)混合物組分的線性相關(guān)系數(shù)較好，表明該方法線性關(guān)系良好。

表1 七種植物生長調(diào)節(jié)劑的線性方程、檢出限和定量限

3.3 回收率和精密度實驗

取空白桃子，制備低、中、高3種濃度（0.1、1和10μg/mL）的加標樣品，按前述樣品前處理方法處理樣品。低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品分別取6份做日內(nèi)精密度分析，得回收率和日內(nèi)相對標準偏差。結(jié)果（表2）表明，低、中、高3個水平樣品的回收率在77.2%～98.1%之間，精密度在0.95%～4.53%之間，說明本方法的重復(fù)性較好、準確度較高。

表2 桃子中植物生長激素的加標回收率

3.4 實際樣品測定，采用上述方法，我們對市售的火龍果和葡萄進行了檢測，結(jié)果如表3所示。從以下結(jié)果可以看出，該方法可以成功的應(yīng)用于水果實際樣品農(nóng)殘的檢測。

表3

4 結(jié)論

四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪鍵合硅膠作為一種新型雜杯芳烴固相萃取材料，其對水果中七種植物生長激素的萃取效果要優(yōu)于商品化的C18固相萃取柱。所建立的NCS固相萃?。疕PLC方法操作簡便、準確度高，適合于不同水果中多種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測。

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1671-0037（2014）11-106-3

張子方（1982.12-），男，本科，工程師，在讀在職研究生，研究方向：分析化學(xué)（儀器分析）。