賴穎，趙錦慧

（周口師范學院生命科學系，河南周口466001）

蘋果醋是近年來蘋果綜合利用開發(fā)出的新產(chǎn)品，其用途非常廣泛，可作為高檔調(diào)味品、醋酸飲料、制成各種類型的保健品以及用于醫(yī)療行業(yè)等[1-3]。將蘋果加工成果汁后釀制的蘋果醋，蘋果中全部的有營養(yǎng)價值的物質(zhì)都分散其中。一般糧食醋中鉀元素、鋅元素等微量元素不足，而蘋果醋可以補充這些微量元素，而且蘋果醋中的維生素、氨基酸、多糖的含量也比較豐富，提高了食用醋的營養(yǎng)價值和保健功能[4-7]。另外，蘋果是我國主要水果產(chǎn)品之一，2011年產(chǎn)量達到3 500 t，占世界產(chǎn)量近50%。我國蘋果主要以鮮食為主，蘋果加工的主導產(chǎn)品是蘋果濃縮汁，產(chǎn)品較為單一，用于加工的蘋果不到產(chǎn)量的10%，而蘋果的產(chǎn)量還在逐年上升，造成蘋果產(chǎn)區(qū)賣果難的問題，農(nóng)民增產(chǎn)不增收，嚴重影響農(nóng)民的生產(chǎn)積極性。因此，蘋果醋的開發(fā)生產(chǎn)對充分利用蘋果資源、提高果農(nóng)收入、豐富醋飲料市場、節(jié)約糧食促進產(chǎn)果區(qū)經(jīng)濟發(fā)展有著重要的意義[8-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

水晶富士蘋果、海天陳醋：市售；發(fā)酵性結(jié)合酵母菌：發(fā)酵工程實驗室提供。

1.1.2 試劑

95%酒精，無水乙醇，葡萄糖，蔗糖，酵母膏，高錳酸鉀，氯化鈉，瓊脂，碳酸鈣。

1.1.3 儀器

九陽水果榨汁機；蒸餾裝置；高壓蒸汽滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；可見分光光度計。

1.1.4 培養(yǎng)基

醋酸菌分離純化平板培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母膏1g，碳酸鈣2g，瓊脂2g，0.04%溴甲酚紫 5mL，水 100mL，121℃滅菌30 min，冷卻至70℃加入無水乙醇4 mL。

醋酸菌液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母膏1.5 g，磷酸二氫鉀 0.05 g，硫酸鎂 0.05 g，水 100 mL，pH 6.5，121℃滅菌30 min，冷卻至60℃以下加無水乙醇3.5 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 醋酸菌的分離

將市場買來的海天陳醋分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，把每個稀釋倍數(shù)分別取 0.2 mL 涂布到分離純化培養(yǎng)基上，并做下標記，在30℃恒溫箱培養(yǎng)3 d。

1.2.2 醋酸菌的純化

挑選醋酸菌分離培養(yǎng)基上的黃色菌落，用接種環(huán)挑取，在醋酸菌純化培養(yǎng)基上劃“Z”字形，在30℃恒溫箱培養(yǎng)得純化的醋酸菌。

1.2.3 蘋果汁的制備

用高錳酸鉀溶液清洗蘋果，切成小塊后浸入1%氯化鈉溶液護色。把處理好的蘋果塊放入榨汁機并加入果膠酶（使粉碎的蘋果多出汁）和VC（防止蘋果被粉碎后氧化褐變），榨成果汁。

1.2.4 蘋果汁糖度測定和調(diào)整

蘋果汁糖度測定采用蒽酮比色法。

1.2.5 酒精發(fā)酵正交試驗

正交設計依據(jù)表1數(shù)據(jù)進行。

表1 酒精發(fā)酵正交條件設計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of alcoholic fermentation

將稱量好的活性干酵母加入10倍體積5%蔗糖溶液中于30℃恒溫中活化30 min，每隔10 min攪拌一次。對調(diào)整過糖度的蘋果汁依據(jù)表2設定的條件進行酒精發(fā)酵正交試驗，發(fā)酵在250 mL錐形瓶進行，每個反應體系為200mL。首先將蘋果汁在80℃滅菌30min，然后根據(jù)正交接種，最后放入各自恒溫培養(yǎng)箱進行發(fā)酵，每天測酒精度。重鉻酸鉀比色法測定酒精度：

1.2.6 醋酸發(fā)酵正交試驗

醋酸發(fā)酵正交試驗基本條件設定如表2所示。

表2 醋酸發(fā)酵正交條件設計Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment of acetic acid fermentation

將活化的醋酸菌接種到種子培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)12 h，得到醋酸種子液，再把種子液接種到經(jīng)調(diào)整的醋酸發(fā)酵液中進行醋酸發(fā)酵。醋酸發(fā)酵產(chǎn)醋酸量用酸堿滴定法，采用0.1 mol/L的NaOH溶液對稀釋十倍的醋酸發(fā)酵液進行滴定，依據(jù)滴定結(jié)果確定各試驗體系的產(chǎn)酸量。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌分離純化結(jié)果

在醋酸菌分離純化培養(yǎng)基上出現(xiàn)的黃圈的菌落即醋酸菌菌落，再經(jīng)鏡檢確認。其原理為：醋酸菌可以產(chǎn)生醋酸使周圍pH降低，而溴甲酚紫在堿性條件下顯紫色，在酸性條件下顯黃色如圖1。

圖1 醋酸菌分離Fig.1 Isolation of aceticacid bacteria

分離純化得出的醋酸菌經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，單生、成對偶爾成短鏈，細胞端平，革蘭氏陽性，亞極生的單鞭毛，無芽孢，見圖2。

圖2 醋酸菌純化Fig.2 Purification of aceticacid bacteria

2.2 酒精發(fā)酵條件的確定

依據(jù)表2設計正交試驗結(jié)果如表3所示。

表3 酒精發(fā)酵正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results of orthogonal experiments for alcoholic fermentation

續(xù)表3 酒精發(fā)酵正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results of orthogonal experiments for alcoholic fermentation

由表3中RB＞RC＞RA可知影響酒精發(fā)酵3個因素的主次關(guān)系是B（糖度）＞C（酵母接種量）＞A（發(fā)酵溫度），最佳組合條件為A1B3C2，即發(fā)酵溫度27℃，糖度20%，酵母接種量8%。在酒精發(fā)酵過程中，選取糖度20%，接種量選取8%，在27℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵，每天測得的酒精度，結(jié)果見圖3。

圖3 酒精度隨時間變化曲線Fig.3 Change curves of alcohol content with time

在糖度和溫度一定的條件下，隨發(fā)酵時間延長酒精度呈現(xiàn)先增長后平穩(wěn)趨勢。在第4天時發(fā)酵液中酒精度達到最高；隨時間延長酒精度呈平穩(wěn)且緩慢下降趨勢。根據(jù)以上結(jié)果，把酒精發(fā)酵時間設置為4 d。

2.3 醋酸發(fā)酵條件的確定

依據(jù)NaOH滴定法中的數(shù)據(jù)得出醋酸發(fā)酵產(chǎn)酸量以及醋酸轉(zhuǎn)化率如表4所示。

表4 醋酸發(fā)酵正交試驗結(jié)果與分析Table4 Results of orthogonal experiments for acetic acid fermentation

由表4的正交試驗結(jié)果可知，影響產(chǎn)酸量的主次因素是初始酒精度＞裝液量＞接種量；最佳條件組合為A’3B’1C’1，即初始酒精度 6%，接種量 20%，裝液量40 mL，發(fā)酵溫度30℃。影響酒精轉(zhuǎn)酸率主次因素是A’＞B’=C’，最佳條件組合為 A’3B’1C’1，即初始酒精度6%，接種量20%，裝液量40 mL，發(fā)酵溫度30℃。

3 結(jié)論

本研究采用三角瓶液體發(fā)酵研究了蘋果醋的發(fā)酵工藝特性，通過酒精發(fā)酵實驗和醋酸發(fā)酵實驗的研究，確定了蘋果醋發(fā)酵的最佳工藝條件。在酒精發(fā)酵過程的研究中，以蘋果汁為原料，最終確定的酒精發(fā)酵最佳條件：起始糖度為20%，發(fā)酵溫度為27℃，活化的酒精酵母接種量為8%，發(fā)酵時間4 d。在所確定的最佳條件下進行酒精發(fā)酵實驗，最終所測得的酒精度可達6.9%。在酒精發(fā)酵過程的研究中，確定了醋酸發(fā)酵的最佳條件。試驗結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為：初始酒精度6%（體積分數(shù)），接種量20%，裝液量40mL，發(fā)酵溫度30℃。

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