陳建興，王銀朝，張慶蛟，陳海偉，趙 冰

（1.赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.山東東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201）

驢朊蛋白基因序列分析

陳建興1，王銀朝2，張慶蛟2，陳海偉1，趙 冰1

（1.赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.山東東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201）

在我國(guó)，家驢及驢產(chǎn)品具有很大的市場(chǎng)開發(fā)潛力和價(jià)值.本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)分析了家驢朊蛋白基因PRNP的序列特征，為家驢向肉用方向進(jìn)行抗病選育提供一定的分子依據(jù).經(jīng)分析研究發(fā)現(xiàn)家驢PRNP基因CDS區(qū)翻譯出255個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽.家驢的朊蛋白中的氨基酸以甘氨酸所占的比例最高（18.43%），其次為纈氨酸（8.63%），最低的為半胱氨酸（1.18%）.對(duì)15條家驢PRNP基因的CDS區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)只發(fā)現(xiàn)了C153T、T237C和G354C三個(gè)突變，并且這三個(gè)突變均為沉默突變.家驢朊蛋白的編碼存在明顯的密碼子使用偏好現(xiàn)象.另外，我們重新界定了家驢朊蛋白各區(qū)塊的具體大小和位置.

驢；朊蛋白；PRNP；序列分析

驢（Equusasinus）馴化成功后，在許多文化體系中，一直作為主要的馱運(yùn)家畜為人類文明的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)[1].時(shí)至今日，在內(nèi)蒙古的許多地區(qū)，如呼和浩特、赤峰等地，仍能見到驢或騾子拉的車作為交通工具拉運(yùn)重物（如建筑工地使用的鋼管）和水果（進(jìn)行販賣）等.另外，驢肉因味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，一直受到廣大消費(fèi)者的厚愛.驢乳因功能獨(dú)特，也逐漸為人們所認(rèn)識(shí)和接納[2].驢皮熬制的阿膠，數(shù)百年來一直作為補(bǔ)品，深受人們喜愛.我國(guó)家驢的養(yǎng)殖數(shù)量在全世界范圍內(nèi)一直處于領(lǐng)先地位，驢產(chǎn)品具有很大的市場(chǎng)開發(fā)潛力和價(jià)值[3,4].

傳染性海綿樣腦軟化病（transmissiblespongiform encephalopathies，TSE）是在人類和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退化性致死性疾病，又稱朊病毒（prion）病.朊蛋白基因（PrionProteingene，PRNP）在正常情況下編碼一種細(xì)胞表面的糖蛋白，通常稱其為細(xì)胞型朊蛋白（PrPc，thecellularform ofprionprotein），通過構(gòu)象轉(zhuǎn)變，PrPc可轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒缘腜rPsc（thescrapieformofprionprotein），而PrPsc在體內(nèi)（一般是腦部）蓄積可引發(fā)朊病毒病[5].朊病毒病在幾種草食動(dòng)物（綿羊、山羊、牛、馬鹿、麂、大角羚）和雜食動(dòng)物（人、貓、水貂）中有過報(bào)道，但在馬屬動(dòng)物中未見有感染此病的報(bào)道，估計(jì)一般情況下，該病毒在各物種間的種屬屏障和潛伏期會(huì)有很大不同.朊蛋白的RNA并非由一個(gè)外顯子構(gòu)成，但整個(gè)開放閱讀框（ORF）包含在一個(gè)單一的外顯子中[5].張?zhí)韬挖w德明對(duì)德州驢與其余7種動(dòng)物朊病毒基因核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有三個(gè)區(qū)域變異較大，認(rèn)為與種屬屏障和朊病毒的潛伏期有關(guān)[6].Zhang等[7]克隆測(cè)序并分析了西吉驢的PRNP基因，并將西吉驢該序列與其余物種進(jìn)行了比對(duì)分析.

對(duì)于家驢朊蛋白基因的研究，只有趙德明進(jìn)行了一些研究[6～8].為此，本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)初步分析家驢朊蛋白基因的序列特征，可以更好地了解朊病毒病的發(fā)病機(jī)理，朊病毒病的傳遞機(jī)制和種間屏障等，可為家驢的抗病育種提供分子依據(jù)，也可為朊病毒病制定相關(guān)預(yù)防控制措施提供一些理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

所使用的家驢和倉(cāng)鼠朊蛋白基因序列，全部來自GenBank，其GenBank登錄號(hào)分別為：EF127815、KC845010-KC845023和K02234.

1.2 分析方法

多重序列比對(duì)采用DNAMAN7.0軟件進(jìn)行，家驢PRNP基因的密碼子使用情況分析也采用DNAMAN7.0來完成.家驢朊蛋白氨基酸組成分析通過MEGA6.0來完成.

2 結(jié)果及分析

2.1 家驢朊蛋白基因的比對(duì)分析

家驢朊蛋白基因的比對(duì)結(jié)果，見圖1.從圖中可見，家驢朊蛋白基因間共發(fā)現(xiàn)三處核苷酸的改變，分別為C153T、T237C和G354C.由此三處核苷酸的改變，可將家驢朊蛋白基因分為CTG（6個(gè)）、TCC（4個(gè)）和TTG（5個(gè)）三種單倍型.這三個(gè)突變中，前二者為嘧啶之間的替換，只有354處為鳥嘌呤和胞嘧啶之間的顛換.對(duì)這些基因序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)突變均為沉默突變，亦即突變未引起氨基酸的改變.

圖1 家驢朊蛋白基因比對(duì)結(jié)果圖

2.2 家驢朊蛋白基因PRNP的密碼子使用情況分析

通過對(duì)家驢的朊蛋白基因PRNP進(jìn)行密碼子使用情況分析發(fā)現(xiàn)，家驢PRNP基因CDS區(qū)共翻譯出255個(gè)氨基酸構(gòu)成多肽，見圖2（圖中顯示256個(gè)密碼子，包含一個(gè)終止密碼子）.家驢的朊蛋白中的氨基酸以甘氨酸所占的比例最高（18.43%，共出現(xiàn)47次），其次為纈氨酸（8.63%，共出現(xiàn)22次），最低的為半胱氨酸（1.18%，共出現(xiàn)3次）.

從圖2還可以看出，除了UAA、UAG兩個(gè)終止密碼子未被使用外，亮氨酸的四個(gè)密碼子（UUA、UUG、CUU和CUA）、絲氨酸的兩個(gè)密碼子（UCA和UCG）、半胱氨酸的一個(gè)密碼子（UGU）、精氨酸的一個(gè)密碼子（CGG）、天冬氨酸的一個(gè)密碼子（GAU）也未被使用.而這幾種氨基酸都由其它密碼子進(jìn)行編碼，說明家驢朊蛋白的編碼存在明顯的密碼子使用偏好.除這幾種明顯的密碼子使用偏好外，其余氨基酸的編碼也存在著較明顯的偏好，見圖2.

另外，圖2中也可看出，密碼子三個(gè)位置各個(gè)核苷酸所占的比例差異較大，密碼子第一位以G所占比例最大，最小為U；密碼子第二位以G所占比例最大，最小為C；密碼子第三位以C所占比例最大，最小為A.

框左邊和右邊分別表示密碼子第一位和第三位的四種核苷酸，框內(nèi)表示的該密碼子翻譯的氨基酸.第一個(gè)數(shù)字表示該密碼子出現(xiàn)的次數(shù)，第二個(gè)數(shù)字表示該密碼子出現(xiàn)次數(shù)占總256個(gè)密碼子的千分率，第三個(gè)數(shù)字表示該密碼子占同類氨基酸密碼子的百分率.框下面顯示的是密碼子三個(gè)位置上各核苷酸所占的比例.

2.3 家驢朊蛋白的基本結(jié)構(gòu)

圖2 家驢朊蛋白基因的密碼子使用情況分析

圖3 家驢朊蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖

圖的上方為密碼子數(shù)列.SP為信號(hào)肽序列；G-PREPEATS是富含Gly-Pro的重復(fù)序列區(qū)；STE是控制朊蛋白拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)的區(qū)域；TM是一段跨膜的α螺旋；AH編碼一個(gè)兩性螺旋；SS編碼一個(gè)疏水信號(hào)序列.

通過將家驢朊蛋白與金倉(cāng)鼠的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，界定好各區(qū)域的大體位置，并通過DNANMAN7.0內(nèi)置的部分功能預(yù)測(cè)了信號(hào)肽和跨膜區(qū)的區(qū)域，綜合起來做出了家驢朊蛋白的基本結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖3.圖3中，上方數(shù)列為密碼子的大體位置，SP為N端含24個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽序列；G-PREPEATS是富含Gly-Pro的重復(fù)序列區(qū)，53-61氨基酸殘基位置處為1個(gè)PQGGGGWGQ的九肽區(qū)，62-85氨基酸殘基位置處為3個(gè)PHGGGWGQ的八肽區(qū)，86-94氨基酸殘基位置處為1個(gè)PHGGGGWGQ的九肽區(qū)；STE是控制朊蛋白拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)的區(qū)域；TM是一段跨膜的α螺旋；AH編碼一個(gè)兩性螺旋；SS編碼一個(gè)疏水信號(hào)序列.

3 討論與結(jié)論

在人和一些易感朊病毒病的哺乳動(dòng)物中，尤其是在一些經(jīng)濟(jì)地位比較突出的家畜，對(duì)于朊蛋白基因的研究比較多見[9～12].而對(duì)于家驢，只是偶見趙德明等對(duì)德州驢和西吉驢的朊蛋白基因的CDS區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增和簡(jiǎn)單的序列分析[6～8]，并未見到更進(jìn)一步的研究報(bào)道.雖然朊蛋白基因是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)非常保守的一個(gè)基因，但其具體功能還不是很清楚[13].對(duì)于家驢來說，該基因編碼蛋白有無變異，變異對(duì)朊病毒病的發(fā)病有無影響，都還是未知的.可見，未來對(duì)此基因的研究具有很大的意義，有可能找到哺乳動(dòng)物朊病毒病的發(fā)病機(jī)制和馬屬動(dòng)物不患朊病毒病的分子機(jī)制，對(duì)家驢產(chǎn)品的進(jìn)一步擴(kuò)大開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ).因此，本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)初步分析家驢朊蛋白基因的序列特征，為將來探尋該基因的變異和作用機(jī)制打下基礎(chǔ).

在已研究的哺乳動(dòng)物中，PRNP是一個(gè)高度保守的基因，所有動(dòng)物的編碼框都編碼一個(gè)約250個(gè)氨基酸的蛋白，編碼朊蛋白的CDS中的DNA和氨基酸序列的相似性分別達(dá)到90%和95%以上[11,14]，據(jù)此推測(cè)該基因在維持動(dòng)物生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性方面可能具有重要作用.從圖1中也可看出，15條家驢朊蛋白基因比對(duì)時(shí)只發(fā)現(xiàn)了C153T、T237C和G354C三個(gè)突變，并且這三個(gè)突變均為沉默突變.這一結(jié)果說明家驢朊蛋白基因非常保守，當(dāng)然，這也與所使用的序列較少有關(guān)，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行下一步研究.

通過對(duì)家驢的朊蛋白基因PRNP進(jìn)行密碼子使用情況分析發(fā)現(xiàn)，家驢朊蛋白的編碼存在明顯的密碼子使用偏好，見圖2.通過家驢PRNP密碼子使用偏好性的研究，可以判定最優(yōu)密碼子，并針對(duì)最優(yōu)密碼子設(shè)計(jì)相應(yīng)的基因工程表達(dá)載體，以提高朊蛋白基因的表達(dá)量，這對(duì)于進(jìn)一步研究朊蛋白的生物功能和朊蛋白病的發(fā)病機(jī)制將具有很大的意義.

圖3中，我們通過將家驢朊蛋白與金倉(cāng)鼠的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，界定了各區(qū)域的大體位置，并通過DNANMAN7.0內(nèi)置的部分功能預(yù)測(cè)了信號(hào)肽和跨膜區(qū)的區(qū)域，綜合起來才做出了家驢朊蛋白的基本結(jié)構(gòu).這就與張?zhí)韬挖w德明的研究結(jié)果[6]有些不相符.其中，我們認(rèn)為SP為N端含24個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽序列，而他們認(rèn)為是前23個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成[6]，這在比對(duì)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)時(shí)能夠看出的確是24個(gè)氨基酸殘基而非23個(gè)；G-P REPEATS中62-85氨基酸殘基位置處為3個(gè)PHGGGWGQ的八肽區(qū)，這通過檢測(cè)和計(jì)算就可得知，而在他們的研究中認(rèn)為是4個(gè)八肽區(qū)[6]，推測(cè)可能是筆誤；SS編碼一個(gè)疏水信號(hào)序列，因?yàn)镾S前面的序列的最后一個(gè)氨基酸在下一步多肽鏈成熟修飾時(shí)會(huì)錨定一個(gè)GPI（糖基磷酸肌醇）[5]，所以，SS前那段氨基酸序列最后一個(gè)氨基酸必須是絲氨酸，這就很好地界定了該處的位置.

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S588.9

A

1673-260X（2014）12-0014-03

2013年度內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZC13306）研究成果