蘇江+岑忠用+吳月圓+覃勇榮

摘要：以鐵皮石斛叢生芽為材料，通過研究不同基本培養(yǎng)基、碳源及天然有機復合物等若干因子對鐵皮石斛叢生芽增殖分化及壯苗生根的影響，篩選出適宜鐵皮石斛組培苗快速繁殖的最佳配方，試圖建立鐵皮石斛組培苗的無菌繁殖系。研究結(jié)果表明，鐵皮石斛叢生芽增殖分化的最適培養(yǎng)基為N6培養(yǎng)基，植株生長健壯；最適碳源為蔗糖；壯苗生根的最適配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+25%香蕉汁+3%白糖，生根率較高。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；叢生芽；增殖；生長

中圖分類號： S567.23+9.043文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0036-03

收稿日期：2013-10-28

基金項目：廣西教育廳項目（編號：2013YB207）；河池學院重點項目（編號：2012YBZ-N002）；廣西高校重點實驗室桂西北特色資源研究與開發(fā)實驗室資助項目（編號：桂教科研[2010]6號）。

作者簡介：蘇江（1980—），女，廣西寧明人，碩士，講師，從事植物組織培養(yǎng)及相關(guān)生物技術(shù)研究。E-mail：suppersujiang@sina.com。石斛屬是蘭科植物中一個較大的屬，全世界約110種，廣泛分布于亞洲、歐洲和大洋洲等地。我國有74種2變種，分布于秦嶺以南諸地區(qū)，尤其以云南南部為多?！吨袊幍洹?005年版記載，能夠入藥的石斛有5種，其中以鐵皮石斛（Dendrobium candidum）最為名貴。鐵皮石斛為蘭科石斛屬多年生草本植物，俗稱鐵皮楓斗，又名黑節(jié)草，因其表皮呈鐵綠色而得名[1]。鐵皮石斛主要生長在高山峻嶺懸崖峭壁和巖石縫隙中，是一種分布在巖溶地區(qū)的珍貴中藥材植物，民間有“救命仙草”“中華仙草”的美稱[2]。鐵皮石斛是一種生長緩慢、自身繁殖能力很低的蘭科附生植物，對生長環(huán)境要求十分嚴格。鐵皮石斛從開花授粉至果實成熟約需6個月，一般借助昆蟲或外力異花傳粉，因而授粉不良，結(jié)果甚少。在自然條件下，種子萌發(fā)因缺乏營養(yǎng)物質(zhì)，需與真菌共生，以獲得養(yǎng)分的供給才能完成萌發(fā)，發(fā)芽率極低。鐵皮石斛種子極小，不含胚乳，自然繁殖十分困難，加上人為的過度采挖和破壞生境，其資源已瀕臨滅絕[3-6]。目前，為滿足國內(nèi)外市場對石斛藥源的需要，須通過人工培育的方法快速繁殖鐵皮石斛。

1材料與方法

1.1試驗材料

由河池學院植物組織培養(yǎng)實驗室提供的鐵皮石斛無菌芽。

1.2試驗方法

1.2.1不同基本培養(yǎng)基對鐵皮石斛叢生芽增殖和生長的影響設3個處理，即以MS、1/2MS、N6為基本培養(yǎng)基，添加激素6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，白糖3%，瓊脂7.0 g/L，pH值5.8～6.0，每個處理0.5 L。

1.2.2不同碳源對鐵皮石斛增殖叢生芽和生長的影響設3個處理，即以白糖3%、蔗糖3%、葡萄糖3%為碳源，添加至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上，瓊脂 7.0 g/L，pH值5.8～6.0，每個處理0.5 L。

1.2.3不同附加物及濃度對鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根的影響設6個處理，即以香蕉汁、馬鈴薯汁各15%、20%、25%為附加物，添加至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培養(yǎng)基上，瓊脂7.0 g/L，pH值5.8～6.0，每個處理 0.5 L。

1.3測定指標及方法

1.3.1石斛芽的增殖率增殖系數(shù)=培養(yǎng)45 d后獲得不定芽數(shù)/接種外植體數(shù)。

1.3.2株高隨機抽取3瓶材料，在無菌超凈臺上用加熱器高溫滅菌的鑷子將石斛苗從培養(yǎng)瓶中取出，每瓶約取出10株，置于培養(yǎng)皿中待用。用尺子測量30株石斛苗的株高，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.4根數(shù)及根長隨機抽取3瓶材料，在無菌超凈臺上從培養(yǎng)瓶中取出約30株石斛苗，放至培養(yǎng)皿中待用。用鑷子輔助數(shù)出肉眼可見的根數(shù)，并用尺子測量其根長，記錄數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1不同基本培養(yǎng)基對叢生芽增殖和生長的影響

試驗結(jié)果表明，在添加激素6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，白糖3%，pH值5.8等同等條件下，鐵皮石斛叢生芽增殖率從高到低排列為N6>1/2MS>MS，即以N6為基本培養(yǎng)基時最適合鐵皮石斛叢生芽的增殖，增殖率最高，增殖系數(shù)達2.0，且芽葉片顏色濃綠，長勢均勻整齊。1/2MS的增殖效果也很明顯，增殖系數(shù)為1.9，但是石斛芽較矮小，顏色略帶黃色。MS的效果最差，增殖率最低，但是MS培養(yǎng)基的石斛芽最健壯，莖的生長最明顯（表1、圖1、圖2、圖3）。

2.2不同碳源對鐵皮石斛叢生芽增殖和生長的影響

試驗結(jié)果表明：不同的碳源對鐵皮石斛的增殖和叢生芽

生長有不同的效果（表2），其中蔗糖的增殖效果最好，葡萄糖次之，白糖的增殖效果最差。另外，從叢生芽生長的情況看，以蔗糖為碳源的叢生芽長勢均勻、整齊健壯且顏色濃綠，平均株高達到2.42 cm；以白糖為碳源的叢生芽長勢與以蔗糖為碳源的叢生芽長勢相似，但平均株高僅為1.83 cm；以葡萄糖為碳源的叢生芽長勢最差，其莖較細，顏色淺綠。

2.3不同附加物對鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根的影響

不同的附加物對鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根具有不同程度的影響。由表3可知，馬鈴薯汁更有利于促進叢生芽的增殖，增殖系數(shù)均達2.1以上，這有利于短期快速獲得大量的試管苗，但褐化現(xiàn)象較嚴重（圖4、圖5、圖6），對誘導生根也具有抑制作用。其中以馬鈴薯汁25%最有利于鐵皮石斛的增殖，但芽長勢較弱。不同濃度香蕉汁增殖效果均比馬鈴薯汁的差，且不同濃度的增殖效果差異不明顯。

3討論

3.1鐵皮石斛叢生芽增殖和生長的最適基本培養(yǎng)基

本研究結(jié)果顯示，N6為基本培養(yǎng)基時鐵皮石斛叢生芽增殖效果較好，這與曾宋君等對5種石斛進行離體培養(yǎng)得出石

斛的通用最適培養(yǎng)基是改良N6培養(yǎng)基的結(jié)果[7]一致。MS為基本培養(yǎng)基時叢生芽增殖效果最差，但MS培養(yǎng)基對石斛莖生長有較好的促進作用，這與郭洪波的研究結(jié)果[8]相同。在比較MS、1/2MS、N6不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛生長的影響時發(fā)現(xiàn)，增殖明顯的石斛芽莖生長不明顯，反之，莖生長較好的增殖率不高。所以研究不同問題時，要根據(jù)需要選擇適合的培養(yǎng)基，本研究認為N6培養(yǎng)基最適合鐵皮石斛的增殖，而MS培養(yǎng)基較有利于莖的生長。

3.2鐵皮石斛組培苗生長的最適碳源

在比較不同碳源對鐵皮石斛生長的影響中，試驗結(jié)果表明，蔗糖對石斛芽的增殖效果最好，長勢整齊健壯，對株高的影響優(yōu)于白糖和葡萄糖，這與魏梅娟等的研究結(jié)果[9]一致。從鐵皮石斛的生長情況看，本研究還發(fā)現(xiàn)以白糖為碳源的叢生芽長勢與以蔗糖為碳源的叢生芽長勢相似，以葡萄為碳源的叢生芽長勢最差，其莖較細，顏色淺綠。因此，本研究認為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)鐵皮石斛組培苗時，在盡量保證苗質(zhì)量的前提下，為了降低生產(chǎn)成本，以白糖作為碳源較合適。

3.3鐵皮石斛壯苗生根的最適附加物及濃度

天然有機物是植物組織培養(yǎng)中常用的添加物[10]，在長期的組織培養(yǎng)實踐中，人們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)加入某些適當?shù)奶烊挥袡C添加物，能夠增強培養(yǎng)物的生長、分化效應，促進培養(yǎng)物更好地存活、發(fā)育。植物組織培養(yǎng)中常用的天然有機添加物包括椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等[11]。本研究以香蕉汁和馬鈴薯汁為附加物，結(jié)果表明，香蕉汁和馬鈴薯汁對鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根培養(yǎng)具有不同的影響。從增殖效果來看，馬鈴薯汁處理更有利于叢生芽的增殖，并以25%馬鈴薯汁的增殖效果最佳，這將有利于短期快速獲得大量的試管苗；但馬鈴薯汁處理褐化現(xiàn)象較嚴重。增殖效果較差的是15%香蕉汁和20%香蕉汁。從根的

生長情況來看，香蕉汁處理的生根率、根數(shù)、根長都優(yōu)于馬鈴薯汁處理，在培養(yǎng)65 d時，3個香蕉汁處理的平均根長都在 0.65 cm 以上，其中以添加25%香蕉汁處理的效果最好，其根長達0.84 cm。從叢生芽的生長情況來看，香蕉汁和馬鈴薯汁對鐵皮石斛叢生芽的生長都有促進作用，在培養(yǎng)65 d時各處理的平均株高達到1.86～2.1 cm，且香蕉汁處理的平均株高均稍大于馬鈴薯汁處理，其中25%香蕉汁處理的株高最大，為2.1 cm。綜合試驗結(jié)果，本研究認為，香蕉汁比馬鈴薯汁更有利于鐵皮石斛壯苗生根培養(yǎng)，且以25%香蕉汁處理效果最佳，這可能是香蕉汁和馬鈴薯汁所含的成分不同所致，有關(guān)這方面還需進一步研究。

參考文獻：

[1]王憲楷，趙同芳. 石斛屬植物的化學成分與中藥石斛[J]. 中國藥學雜志，1986，21（11）：666-669.

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[3]淳澤. 藥用石斛的資源危機與保護對策[J]. 資源開發(fā)與市場，2005，21（2）：139-140.

[4]劉瑞駒，蒙愛東，鄧錫青，等. 鐵皮石斛試管苗快速繁殖的研究[J]. 藥學學報，1988，23（8）：636-640.

[5]張治國，劉燁，王黎，等. 鐵皮石斛原球莖增殖的培養(yǎng)條件研究[J]. 中草藥，1992，23（8）：431-433.

[6]廖俊杰，許繼勇，李進進，等. 鐵皮石斛試管種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)因素分析[J]. 中藥材，2006，29（6）：533-535.

[7]曾宋君，程式君，張京麗，等. 五種石斛蘭的胚培養(yǎng)及其快速繁殖研究[J]. 園藝學報，1998，25（1）：76-81.

[8]郭洪波. 鐵皮石斛（Dendrobium candidum）組培快繁及其抗癌作用的研究[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學，2008：3-10.

[9]魏梅娟，李 雪，葉清梅，等. 鐵皮石斛組培苗生長的影響因素研究[J]. 北方園藝，2011（2）：146-148.

[10]曹孜義，劉國民. 實用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M]. 蘭州：甘肅科學技術(shù)出版社，2002：85-126.

[11]劉曉燕，向青云，劉玲玲，等. 基本培養(yǎng)基及附加物對蝴蝶蘭原球莖增殖效果的影響[J]. 種子，2005，24（6）：18-20，26.

本研究結(jié)果顯示，N6為基本培養(yǎng)基時鐵皮石斛叢生芽增殖效果較好，這與曾宋君等對5種石斛進行離體培養(yǎng)得出石

斛的通用最適培養(yǎng)基是改良N6培養(yǎng)基的結(jié)果[7]一致。MS為基本培養(yǎng)基時叢生芽增殖效果最差，但MS培養(yǎng)基對石斛莖生長有較好的促進作用，這與郭洪波的研究結(jié)果[8]相同。在比較MS、1/2MS、N6不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛生長的影響時發(fā)現(xiàn)，增殖明顯的石斛芽莖生長不明顯，反之，莖生長較好的增殖率不高。所以研究不同問題時，要根據(jù)需要選擇適合的培養(yǎng)基，本研究認為N6培養(yǎng)基最適合鐵皮石斛的增殖，而MS培養(yǎng)基較有利于莖的生長。

3.2鐵皮石斛組培苗生長的最適碳源

在比較不同碳源對鐵皮石斛生長的影響中，試驗結(jié)果表明，蔗糖對石斛芽的增殖效果最好，長勢整齊健壯，對株高的影響優(yōu)于白糖和葡萄糖，這與魏梅娟等的研究結(jié)果[9]一致。從鐵皮石斛的生長情況看，本研究還發(fā)現(xiàn)以白糖為碳源的叢生芽長勢與以蔗糖為碳源的叢生芽長勢相似，以葡萄為碳源的叢生芽長勢最差，其莖較細，顏色淺綠。因此，本研究認為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)鐵皮石斛組培苗時，在盡量保證苗質(zhì)量的前提下，為了降低生產(chǎn)成本，以白糖作為碳源較合適。

3.3鐵皮石斛壯苗生根的最適附加物及濃度

天然有機物是植物組織培養(yǎng)中常用的添加物[10]，在長期的組織培養(yǎng)實踐中，人們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)加入某些適當?shù)奶烊挥袡C添加物，能夠增強培養(yǎng)物的生長、分化效應，促進培養(yǎng)物更好地存活、發(fā)育。植物組織培養(yǎng)中常用的天然有機添加物包括椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等[11]。本研究以香蕉汁和馬鈴薯汁為附加物，結(jié)果表明，香蕉汁和馬鈴薯汁對鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根培養(yǎng)具有不同的影響。從增殖效果來看，馬鈴薯汁處理更有利于叢生芽的增殖，并以25%馬鈴薯汁的增殖效果最佳，這將有利于短期快速獲得大量的試管苗；但馬鈴薯汁處理褐化現(xiàn)象較嚴重。增殖效果較差的是15%香蕉汁和20%香蕉汁。從根的

生長情況來看，香蕉汁處理的生根率、根數(shù)、根長都優(yōu)于馬鈴薯汁處理，在培養(yǎng)65 d時，3個香蕉汁處理的平均根長都在 0.65 cm 以上，其中以添加25%香蕉汁處理的效果最好，其根長達0.84 cm。從叢生芽的生長情況來看，香蕉汁和馬鈴薯汁對鐵皮石斛叢生芽的生長都有促進作用，在培養(yǎng)65 d時各處理的平均株高達到1.86～2.1 cm，且香蕉汁處理的平均株高均稍大于馬鈴薯汁處理，其中25%香蕉汁處理的株高最大，為2.1 cm。綜合試驗結(jié)果，本研究認為，香蕉汁比馬鈴薯汁更有利于鐵皮石斛壯苗生根培養(yǎng)，且以25%香蕉汁處理效果最佳，這可能是香蕉汁和馬鈴薯汁所含的成分不同所致，有關(guān)這方面還需進一步研究。

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本研究結(jié)果顯示，N6為基本培養(yǎng)基時鐵皮石斛叢生芽增殖效果較好，這與曾宋君等對5種石斛進行離體培養(yǎng)得出石

斛的通用最適培養(yǎng)基是改良N6培養(yǎng)基的結(jié)果[7]一致。MS為基本培養(yǎng)基時叢生芽增殖效果最差，但MS培養(yǎng)基對石斛莖生長有較好的促進作用，這與郭洪波的研究結(jié)果[8]相同。在比較MS、1/2MS、N6不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛生長的影響時發(fā)現(xiàn)，增殖明顯的石斛芽莖生長不明顯，反之，莖生長較好的增殖率不高。所以研究不同問題時，要根據(jù)需要選擇適合的培養(yǎng)基，本研究認為N6培養(yǎng)基最適合鐵皮石斛的增殖，而MS培養(yǎng)基較有利于莖的生長。

3.2鐵皮石斛組培苗生長的最適碳源

在比較不同碳源對鐵皮石斛生長的影響中，試驗結(jié)果表明，蔗糖對石斛芽的增殖效果最好，長勢整齊健壯，對株高的影響優(yōu)于白糖和葡萄糖，這與魏梅娟等的研究結(jié)果[9]一致。從鐵皮石斛的生長情況看，本研究還發(fā)現(xiàn)以白糖為碳源的叢生芽長勢與以蔗糖為碳源的叢生芽長勢相似，以葡萄為碳源的叢生芽長勢最差，其莖較細，顏色淺綠。因此，本研究認為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)鐵皮石斛組培苗時，在盡量保證苗質(zhì)量的前提下，為了降低生產(chǎn)成本，以白糖作為碳源較合適。

3.3鐵皮石斛壯苗生根的最適附加物及濃度

天然有機物是植物組織培養(yǎng)中常用的添加物[10]，在長期的組織培養(yǎng)實踐中，人們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)加入某些適當?shù)奶烊挥袡C添加物，能夠增強培養(yǎng)物的生長、分化效應，促進培養(yǎng)物更好地存活、發(fā)育。植物組織培養(yǎng)中常用的天然有機添加物包括椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等[11]。本研究以香蕉汁和馬鈴薯汁為附加物，結(jié)果表明，香蕉汁和馬鈴薯汁對鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根培養(yǎng)具有不同的影響。從增殖效果來看，馬鈴薯汁處理更有利于叢生芽的增殖，并以25%馬鈴薯汁的增殖效果最佳，這將有利于短期快速獲得大量的試管苗；但馬鈴薯汁處理褐化現(xiàn)象較嚴重。增殖效果較差的是15%香蕉汁和20%香蕉汁。從根的

生長情況來看，香蕉汁處理的生根率、根數(shù)、根長都優(yōu)于馬鈴薯汁處理，在培養(yǎng)65 d時，3個香蕉汁處理的平均根長都在 0.65 cm 以上，其中以添加25%香蕉汁處理的效果最好，其根長達0.84 cm。從叢生芽的生長情況來看，香蕉汁和馬鈴薯汁對鐵皮石斛叢生芽的生長都有促進作用，在培養(yǎng)65 d時各處理的平均株高達到1.86～2.1 cm，且香蕉汁處理的平均株高均稍大于馬鈴薯汁處理，其中25%香蕉汁處理的株高最大，為2.1 cm。綜合試驗結(jié)果，本研究認為，香蕉汁比馬鈴薯汁更有利于鐵皮石斛壯苗生根培養(yǎng)，且以25%香蕉汁處理效果最佳，這可能是香蕉汁和馬鈴薯汁所含的成分不同所致，有關(guān)這方面還需進一步研究。

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[8]郭洪波. 鐵皮石斛（Dendrobium candidum）組培快繁及其抗癌作用的研究[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學，2008：3-10.

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