姜濤 陳林明 林岱濱

超高效液相色譜法測定三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的方法研究

姜濤 陳林明 林岱濱

目的建立超高效液相色譜法測定三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量的方法。方法采用Agilent 1290型高效液相色譜儀, ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1×50 mm, 1.8 μm)色譜柱, 以乙腈-水為流動相, 梯度洗脫, 流速為0.22 ml/min, 檢測波長為203 nm, 進(jìn)樣量為0.4 μl, 柱溫為40℃。結(jié)果三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在25 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離, 峰面積在選定的濃度范圍內(nèi)線性良好, 方法回收率、精密度良好。結(jié)論超高效液相色譜法可以作為三七藥材質(zhì)量控制的一種快速、方便、可靠的檢測手段。

超高效液相色譜法；三七；同時測定

超高效液相色譜法(ultra high performance liquid chromatography , UHPLC)是一種應(yīng)用小顆粒填料和超高壓輸液泵的一種新的檢測技術(shù)。與傳統(tǒng)高效液相色譜法(HPLC)相比,超高效液相色譜法具有更快的分析速度［1］。近幾年分析者發(fā)現(xiàn)超高效液相色譜法也很適用中藥這一復(fù)雜體系的分析［2］。

三七來源為五加科人參屬三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根［3］, 具有散瘀止血, 消腫定痛的功效, 主要治療咯血, 吐血, 衄血, 便血, 崩漏, 外傷出血, 胸腹刺痛,跌撲腫痛［4］, 有“止血神藥”之稱。2010版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《藥典》)中以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1作為三七含量測定的指標(biāo)［3］。但洗脫過程需要60 min, 加上后平衡時間, 一個樣品的分析時長大概得75 min, 耗時較長。本研究在《藥典》HPLC條件基礎(chǔ)上,利用UHPLC建立了三七含量的快速測定方法。結(jié)果表明：與傳統(tǒng)HPLC方法相比, 該法具有可明顯縮短分析周期、靈敏度高和節(jié)省溶劑的的優(yōu)點(diǎn), 有良好的應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

超高效液相色譜儀, Agilent 1290 Infinity型(包括二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱及二極管陣列檢測器), 人參皂苷Rg1對照品(中國食品藥品檢定研究院, 批號: 110703-201128)、

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：ZORBAX Ecilpse plus C18, RRHD 2.1×50 mm, 1.8 μm；流動相：乙腈(A)-水(B), 梯度洗脫［2.4→8 min, 19:81→20:80; 8→12 min, 20:80→36:64; 12→15 min, 36:64→36:64; 15→16 min, 36:64→79:21; 16→20 min, 79:21→79:21］；流速：0.220 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：0.4 μ l。對照品及供試品色譜圖見圖1, 圖2。

圖1 三七混合對照品色譜圖

圖2 三七供試品色譜圖

2.2對照品溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品適量, 加甲醇制成每1毫升含三七皂苷R10.1 mg、人參皂苷Rg10.3 mg、人參皂苷Rb10.4 mg的混合溶液, 搖勻, 0.22 μm濾過, 取續(xù)濾液, 即得。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取三七粉末(過四號篩)0.6 g, 精密稱定, 精密加入甲醇50 ml, 稱定重量, 放置過夜, 置80℃水浴上保持微沸2 h, 放冷, 再稱定重量, 用甲醇補(bǔ)足減失的重量, 搖勻, 0.22 μm濾過, 取續(xù)濾液, 即得。

2.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μl, 注入超高效液相色譜儀, 以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo), 對照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得到人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1三種成分的回歸方程。三七皂苷R1的回歸方程為Y=7292.6X-20.380(r=0.9999),線性范圍為0.0216～0.0648 μg；人參皂苷Rg1的回歸方程為Y=7806.7X-50.820 (r=0.9998), 線性范圍為0.0606～0.1819 μg；人參皂苷Rb1的回歸方程為Y=6970.8X-43.810(r=0.9999), 線性范圍為0.0819～0.2458 μg。表明該方法線性關(guān)系良好。

2.5準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱取已知含量的三七藥材粉末6份,每份約0.4 g, 精密稱定, 置于250 ml具塞錐形瓶中, 精密加入混合對照品溶液20 ml, 按“2.3”項(xiàng)目下的方法制備供試品溶液, 依“2.1”法測定, 計(jì)算三個組分回收率, 平均回收率如下：三七皂苷R1為 101.19%, RSD為2.9%, 人參皂苷Rg1為118.02%, RSD為0.9%, 人參皂苷Rb1為99.73%, RSD為0.9%。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6精密度試驗(yàn) 精密稱取三七藥材粉末0.6 g, 按“2.3”項(xiàng)目下進(jìn)行處理得供試品溶液, 平行操作6份, 按照“2.1”項(xiàng)目下的色譜條件進(jìn)行測定, 記錄三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的峰面積, 并計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD,其結(jié)果分別為1.08%、0.71%、0.49%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.6”項(xiàng)下供試品溶液, 按照“2.1”項(xiàng)目下的色譜條件分別于0、2、4、8、12、20 h進(jìn)行測定,記錄三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的峰面積,并計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD, 其結(jié)果分別為0.98%、1.57%、0.38%, 表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

3.1在本次試驗(yàn)中, 三七中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的色譜峰與相鄰峰的分離度分別為3.6、8.7和3.4, 均符合2010版《中華人民共和國藥典》的附錄要求。與HPLC方法相比, UHPLC方法明顯地降低檢測時間, 在13 min內(nèi)即可將三七中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三種待測成分完全分離。

3.2相對HPLC常用5 μm粒徑的填料, UHPLC使用的1.8 μm的填料粒徑更小, 根據(jù)范德米特(Van Deemeter)方程, 小粒徑填料可得到更佳的柱效, 可縮短分析時間。另外, 選用2.1 mm內(nèi)徑的色譜柱, 可有效減少溶劑擴(kuò)散效應(yīng), 達(dá)到高分離效率的需求。但由于整柱體積比以往色譜柱小, 分析復(fù)雜樣品時更容易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象, 故在15 min后用高強(qiáng)度有機(jī)相沖洗以防止柱堵塞現(xiàn)象。

綜上所述, 采用超高效液相色譜法測定三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量, 大大降低了三七含量測定時間, 提高了工作效率, 可以作為三七藥材質(zhì)量控制的一種快速、方便、可靠的檢測手段。

［1］ 楊喬森.超高效液相色譜的特點(diǎn)分析及在藥物領(lǐng)域的應(yīng)用.中國石油和化工標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量, 2012, 33(10):230.

［2］ 金高娃, 章飛芳, 薛興亞, 等.超高效液相色譜在復(fù)雜體系中藥分離分析中的應(yīng)用.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2006, 8(3):106-111.

［3］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2010:11-12.

［4］ 肖培根.新編中藥志.第1卷.北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2001: 17-22.

Method study of ultra high performance liquid chromatography in determination of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in panax notoginseng

JIANG Tao, CHEN Lin-ming, LIN Dai-bin.

Kangmei Pharmaceutical Co, Jieyang 515300, China

ObjectiveTo establish the determination method for notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in panax notoginseng by ultra high performance liquid chromatography.MethodsThis study was performed on Agilent 1290 high performance liquid chromatography and ZORBAX Ecilpse Plus C18(2.1×50 mm, 1.8 μm) chromatographic column with acetonitrile-water as mobile phase in gradient elution at the flow rate of 0.220 ml/min.The detection wavelength was 203 nm, the injection volume was 0.4 μl, and the column temperature was 40℃.ResultsNotoginsenoside R1, ginsenosides Rg1and ginsenosides Rb1in panax notoginseng could be completely separated in 25 min.The peak area had good linear relationship in the certain range.The recovery rate and precision of the method were good.ConclusionAs an new quality control method of panax notoginseng, ultra high performance liquid chromatography is fast, convenient and reliable.

Ultra high performance liquid chromatography; Panax notoginseng; Simultaneous determination

515300 康美藥業(yè)股份有限公司人參皂苷Rb1對照品(中國食品藥品檢定研究院, 批號: 110704-201122)、三七皂苷R1對照品(中國藥品生物制品檢定所, 批號: 110745-200415)；乙腈(Merck, 批號: I68253031)為色譜純；水為Sartorius 超純水；其他試劑為分析純；三七藥材, 經(jīng)康美藥業(yè)股份有限公司劉茂貴技術(shù)顧問鑒定為五加科人參屬三七。

2014-08-11］