楊智航 張量 孟慶超 閆安

·實(shí)驗(yàn)研究·

蛙皮素對大鼠IL-1β性發(fā)熱反應(yīng)及下丘腦中HSP70含量的影響

楊智航 張量 孟慶超 閆安

目的研究蛙皮素(BN)對白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)引起的發(fā)熱反應(yīng)的影響, 并探討其與熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的關(guān)系。方法成年健康SD雄性大鼠80只, 隨機(jī)分為四組：對照組(Control組)、蛙皮素組(BN組)、白細(xì)胞介素-1β組(IL-1β組)、蛙皮素+白細(xì)胞介素-1β組(BN+IL-1β組), 檢測大鼠體溫變化情況, 采用Western blot方法測定大鼠下丘腦中HSP70表達(dá)的變化。結(jié)果與Control組相比, IL-1β組大鼠體溫升高, 下丘腦中HSP70含量顯著升高(P＜0.05)；BN組大鼠體溫降低,下丘腦中HSP70含量顯著降低(P＜0.05)；BN+IL-1β組預(yù)先10 min側(cè)腦室注射BN, 能明顯抑制大鼠IL-1β性發(fā)熱, 且體溫及下丘腦中HSP70含量變化范圍介于IL-1β組與BN組之間(P＜0.05)。結(jié)論蛙皮素對IL-1β性發(fā)熱反應(yīng)具有拮抗作用, 其機(jī)制有可能與HSP70表達(dá)水平有關(guān)。

蛙皮素；白細(xì)胞介素-1β；熱休克蛋白質(zhì)70；發(fā)熱

體溫是反應(yīng)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要指標(biāo), 長期發(fā)熱或高熱會影響機(jī)體正常新陳代謝, 引起下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞合成熱休克蛋白70(Heat Shock Protein 70, HSP70)增多, 以增強(qiáng)細(xì)胞對損害的耐受程度, 維持細(xì)胞的正常功能代謝。蛙皮素(bombesin, BN)具有強(qiáng)烈的降低體溫作用, 但其作用機(jī)制尚無一致性結(jié)論。本研究旨在探討B(tài)N的降溫作用與HSP70表達(dá)之間的關(guān)系, 分析BN降低體溫中HSP70的作用, 進(jìn)而為BN在臨床治療發(fā)熱奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1藥品與儀器 BN, IL-1β(北京寶賽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品), HSP70抗體。SN-2型立體定位儀(日本東京儀器廠), SN2202型數(shù)字溫度計(jì)(北京司南儀器廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供成年健康雄性SD大鼠, 體重180～210 g。在室溫(22±2)℃、濕度(50±2)%、光照6:00～18:00的條件下單籠飼養(yǎng), 自由進(jìn)食水。80只大鼠隨機(jī)分為四組, 每組20只：Control組側(cè)腦室注射人工腦脊液10 μl；BN組側(cè)腦室注射BN 0.7 μg/10 μl；IL-1β組側(cè)腦室注射IL-1β 0.1 μg/10 μl、BN+IL-1β組側(cè)腦室先注射BN 0.7 μg/10 μl, 10 min后再注射IL-1β 0.1 μg/10 μl。

1.3側(cè)腦室插管、給藥及體溫測量 大鼠稱重麻醉后, 用立體定位儀固定, 按Pellegrine 圖譜向右側(cè)腦室置入P10～P20組合的腦室插管, 用牙科水泥固定, 生理鹽水測試插管通暢,加熱封閉插管上端塑料管［1］。常規(guī)、單籠飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn), 剪去封閉的塑料管, 經(jīng)側(cè)腦室插管給藥, 單次劑量均為10 μl。

實(shí)驗(yàn)前對大鼠測溫7 d, 使其習(xí)服操作人手法。數(shù)字溫度計(jì)探頭插入大鼠直腸6 cm, 數(shù)字穩(wěn)定后讀數(shù)。將給藥前1 h內(nèi)測得的3次直腸溫度的平均值作為大鼠的基礎(chǔ)體溫, 可用范圍(37.5±1.0)℃。經(jīng)側(cè)腦室給藥后分別記錄下15、30、45、60、90、120、180 min時(shí)的大鼠直腸溫度值, 輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 獲得發(fā)熱潛伏時(shí)、ΔT(即時(shí)體溫與基礎(chǔ)體溫之差)、發(fā)熱高峰時(shí), 利用這些數(shù)據(jù)做出發(fā)熱標(biāo)準(zhǔn)曲線, 體溫變化情況采用發(fā)熱高峰ΔTmax和體溫反應(yīng)指數(shù)(temperature response index, TRI)分析。

1.4Western blot法檢測HSP70的表達(dá)水平 根據(jù)各組溫度曲線, 在IL-1β體溫達(dá)到峰值時(shí)間點(diǎn), 即給藥后90 min斷頭取下丘腦, 即刻置液氮冷凍, 而后-80℃保存。HSP70為小鼠抗大鼠抗體, 稀釋比1:200, 以β-actin為內(nèi)對照, 采用Fluor Chen 2.0軟件對各條帶的整合光密度值(integrated density value, IDV)進(jìn)行定量分析, 結(jié)果以HSP70/β-actin的IDV比值表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1側(cè)腦室給藥后各組體溫反應(yīng)曲線 通過留置于SD大鼠側(cè)腦室的插管給藥10 μl后, 見圖1：Control組注射人工腦脊液后無明顯發(fā)熱, 各時(shí)間點(diǎn)體溫變化不大；IL-1β組注射0.1 μg/10 μl IL-1β后體溫逐漸升高, 90 min時(shí)達(dá)到峰值, 而后逐漸下降, 各時(shí)間點(diǎn)體溫均高于Control組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；BN組注射0.7 μg/10 μl BN后體溫先逐漸下降, 60 min時(shí)達(dá)到最低點(diǎn), 而后逐漸上升, 各時(shí)間點(diǎn)體溫均低于Control組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；BN+IL-1β組先注射0.7 μg/10 μl BN, 10 min后注射0.1 μg/10 μl IL-1β,體溫反應(yīng)曲線呈“S”型, 各時(shí)間點(diǎn)體溫值基本介于IL-1β組和BN組之間, 且90 min前低于Control組, 90 min后高于Control組, 最低點(diǎn)和最高點(diǎn)分別出現(xiàn)在30 min和120 min, 除 90 min點(diǎn)外, 其余各時(shí)間點(diǎn)體溫與Control組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與Control組相比, 各實(shí)驗(yàn)組體溫均有改變, 且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), ΔTmax從低到高的順序:Contorl組＜BN+IL-1β組＜BN組＜IL-1β組, 各組TRI3的變化趨勢與ΔTmax相同。實(shí)驗(yàn)過程中各組的最大體溫變化值(ΔTmax)及體溫反應(yīng)指數(shù)TRI3數(shù)據(jù)見表1。

圖1 不同組大鼠體溫變化曲線

表1不同組最大體溫變化值及體溫反應(yīng)指數(shù)比較

表1不同組最大體溫變化值及體溫反應(yīng)指數(shù)比較

注：與Control組比較,aP＜0.05

組別樣本例數(shù)ΔTmax(℃)TRI3(℃· h) Control組200.27±0.180.71±0.23 IL-1β組202.05±0.29a4.23±0.68aBN組201.96±0.32a3.64±1.67aBN+IL-1β組201.35±0.25a2.57±0.84a

2.2Western blot法測定HSP70的表達(dá)水平 Control組和BN+IL-1β組下丘腦組織中HSP70表達(dá)水平相近, 且明顯低于IL-1β組, 而高于BN組。 各組條帶HSP70/β-actin的IDV比值, 由低到高順序?yàn)锽N組(0.1545±0.0146)＜Control組(0.2348±0.0221)＜ BN+IL-1β組(0.2432±0.0235)＜IL-1β組(0.3147±0.0327), 除Control組和BN+IL-1β組兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)外, 其余各組兩兩比較, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組下丘腦組織中HSP70蛋白的表達(dá),見圖2。

圖2 各組下丘腦組織中HSP70的表達(dá)

3 討論

作者的研究結(jié)果顯示：側(cè)腦室注射外源性IL-1β后,可引起大鼠體溫逐漸升高, 90 min時(shí)達(dá)到峰值, 同時(shí)HSP70的表達(dá)水平也顯著高于Control組及其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。這提示發(fā)熱可以使機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài), 誘導(dǎo)HSP70這種重要的應(yīng)激反應(yīng)蛋白表達(dá)增高, 發(fā)揮保護(hù)性作用。Mathur 等［2］認(rèn)為,若高溫應(yīng)激未能引起HSP70的高表達(dá), 則中暑發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性更大。其機(jī)制可能是由于HSP70可以通過保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu), 修復(fù)高溫引起的蛋白質(zhì)和DNA損傷, 調(diào)節(jié)重要功能蛋白質(zhì)的分布, 并促進(jìn)其功能實(shí)現(xiàn), 以維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài), 增強(qiáng)細(xì)胞抗御損傷的能力［3］。馬中女等［4］研究證實(shí), 外源性致熱源脂多糖(LPS)引起發(fā)熱時(shí), 可激活HSP70, 進(jìn)而抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β等內(nèi)生致熱源的產(chǎn)生而控制體溫升高。

BN是一種具有廣泛生物學(xué)活性的腦腸肽, 參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié), 尤其是在體溫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。有研究證明：BN具有調(diào)節(jié)內(nèi)源性精氨酸加壓素(AVP)的釋放能力, 在干擾素(IFN)引起發(fā)熱時(shí), 可能通過增加AVP的釋放量, 使體溫恢復(fù)正常［5］；BN還具有抑制前列腺素(PGE)［6］或cAMP的合成與釋放的作用, 這可能是BN降低大鼠正常體溫和抑制IL-1β的致熱作用的關(guān)鍵。研究結(jié)果顯示：側(cè)腦室注射BN可使大鼠體溫降低, 其下丘腦中HSP70含量顯著降低(P＜0.05)；預(yù)先10 min側(cè)腦室注射BN, 能明顯抑制大鼠IL-1β性發(fā)熱, 且體溫及下丘腦中HSP70含量變化范圍介于IL-1β組與BN組之間(P＜0.05), 提示BN拮抗IL-1β性發(fā)熱可能與降低HSP70的表達(dá)水平有關(guān)。但BN引起的HSP70的表達(dá)降低后通過哪種信號傳導(dǎo)路發(fā)揮作用, 尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究結(jié)果表明：大鼠下丘腦HSP70蛋白含量在IL-1β性發(fā)熱時(shí)明顯增加, 在BN引起降溫作用時(shí)則降低, BN能夠拮抗IL-1β性發(fā)熱, 這種拮抗作用可能與HSP70表達(dá)水平有關(guān)。

［1］ 張琪, 譚穎穎.側(cè)腦室慢性灌流(pyr1)apelin-13對大鼠心血管功能的影響.中國藥理學(xué)通報(bào), 2014, 30(1):144-145.

［2］ Mathur S, Walley KR, Wang Y, et al.Extracellular heat shock protein 70 induces cardiomyocyte inflammation and contractile dysfunction via TLR2.Circ J, 2011, 75(10):2445-2452.

［3］ Luo Q, Jiang L, Chen G, et al.Constitutive heat shock protein 70 interacts with α-enolase and protects cardiomyocytes against oxidative stress.Free Radic Res, 2011, 45(11-12):1355-1365.

［4］ 馬中女, 楊麗娟, 蔣淑君, 等.家兔發(fā)熱過程中單核細(xì)胞熱休克蛋白70表達(dá)與白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α mRNA表達(dá)的關(guān)系.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(3):16-20.

［5］ 周曉陽, 張 量, 趙書芬.蛙皮素對大鼠IFN性發(fā)熱反應(yīng)及腦內(nèi)AVP含量的影響.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2004, 20(3):393-396.

［6］ 張量, 孫大宇, 江敏.低溫時(shí)蛙皮素對IL-1β致熱大鼠的降溫作用及與PGE2的相關(guān)性.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2011, 8(5):21-23.

2014-08-01］

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：2011225020)

110034 沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室

張量