王翠芬 呂彩蓮 彭思梅 黃玉蘭 陳建萍

·論著·

HPLC法測定阿膠中6種氨基酸的含量

王翠芬 呂彩蓮 彭思梅 黃玉蘭 陳建萍

目的通過柱前衍生化, 高效液相色譜(HPLC)法測定阿膠中6種氨基酸的含量。方法色譜柱為Hypersil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流動相A：乙腈-0.1mol/L乙酸鈉(7：93), 用乙酸調(diào)節(jié)pH為6.5, 流動相B：乙腈-水(4：1), 梯度洗脫；柱溫為42℃；流速為1.0 ml/min；檢測波長254 nm；異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化。結(jié)果30 min內(nèi)6種氨基酸分離完全, 峰面積與濃度的線性關系良好, r=0.999。加樣回收率97.33%～100.17%, RSD＜3。結(jié)論HPLC法測定阿膠中6種氨基酸的含量方法操作流程簡單、快速、準確, 可用于該制劑的質(zhì)量控制和檢驗。

HPLC；阿膠；氨基酸；含量

阿膠為馬科動物驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠［1］。具有補血止血, 滋陰潤肺的功能。臨床多用于血虛萎黃、眩暈心悸、肺燥咳嗽、吐血尿血、便血崩漏、妊娠胎漏等［2］。阿膠主要是由蛋白質(zhì)(約含80%)、氨基酸以及多種微量元素組成, 其藥理作用與其所含氨基酸和微量元素有關。阿膠中至少含有17種水解蛋白氨基酸, 以甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和精氨酸為主要氨基酸, 均占總氨基酸含量的7%以上［3］。阿膠中含有8種人體必需氨基酸,占總氨基酸含量的15.98%～20.22%, 以賴氨酸和精氨酸的含量最高, 約占4%～5.20%和7.15%～10.06%。本文通過HPLC法, 柱前衍生化測定阿膠中主要的6種氨基酸：L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸的含量。

1 材料

1. 1儀器 STI2000高效液相色譜儀(Model500高壓輸液泵, UV501可變波長檢測器, VI2010色譜工作站)。電子天平(1/10萬, 賽多利斯科學儀器北京有限公司)。KQ-250E超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司)。真空泵(廣東海利集團)。SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)。SZ-97A自動三重水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。AE240分析天平(METTLER)

1. 2試劑 L-羥脯氨酸對照品(111578-200201)、甘氨酸對照品(140689-201103)、丙氨酸對照品(110873-201203)、L-脯氨酸對照品(140677-200405)、谷氨酸對照品(140690-201203)和精氨酸對照品(140685-200802)均為中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈、乙酸鈉、正己烷為色譜純；異硫氰酸苯酯及其他試劑均為分析純。阿膠由山東福膠集團東阿鎮(zhèn)阿膠有限公司提供。

2 方法

2. 1色譜條件 STI2000高效液相色譜儀, Vertex C18色譜柱為Hypersil C18(4.6×250 mm ＞ 5 μm), UV501紫外檢測器。流動相A：乙腈-0.1 mol/L乙酸鈉(7：93), 用乙酸調(diào)節(jié)pH為6.5, 流動相B：乙腈-水(4：1), 按表1進行梯度洗脫。柱溫為42℃；流速為1.0 ml/min；5 μl定量管進樣, 檢測波長為254 nm。理論塔板數(shù)按照L-羥脯氨酸計＞4000。

表1 梯度洗脫程序

2. 2溶液的制備

2. 2. 1混合對照品溶液的配制 取L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸對照品適量, 精密稱定,加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml分別含L-羥脯氨酸0.36 mg、甘氨酸0.92 mg、丙氨酸0.33 mg、L-脯氨酸0.51 mg、谷氨酸0.43 mg和精氨酸0.44 mg的混合對照品溶液。

2. 2. 2樣品溶液的配制 取阿膠粗粉約0.25 g, 精密稱定,置25 ml量瓶中, 加0.1 mol/L鹽酸溶液20 ml, 超聲處理30 min(功率500 W, 頻率40 Hz), 放冷, 加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度, 搖勻。精密量取2 ml置5 ml安瓶中, 加濃鹽酸2 ml,拉絲封口, 150℃水解1 h, 放冷, 移至蒸發(fā)皿中, 用水10 ml分次洗滌, 洗液并入蒸發(fā)皿中, 蒸干, 殘渣加0.1 mol/L鹽酸溶解, 移至25 ml量瓶中, 加0.1 mol/L鹽酸至刻度, 搖勻即得。

2. 2. 3異硫氰酸苯酯(PITC)衍生化物的制備 取上述6種氨基酸混合對照品溶液和樣品溶液各2 ml, 分別置10 ml離心管中, 各加0.1 mol/L PITC的乙腈溶液1.0 ml, 1 mol/L三乙胺的乙腈溶液1.0 ml, 漩渦混合1 min, 放置1 h后, 加正己烷4 ml, 漩渦混合1 min, 放置10 min, 取下層溶液再次加正己烷4 ml萃取, 放置10 min, 取下層溶液, 濾過, 取續(xù)濾液, 即得。

3 結(jié)果

3. 1可行性考察 按“2.1”項下色譜條件進行測定, L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸分離度良好, 見圖1。

圖1 對照品(A)與樣品(B)HPLC色譜圖

3. 2線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液1、2、3、4、5、 6 ml, 分別置于10 ml量瓶中, 用0.1 mol/L鹽酸加至刻度, 搖勻, 按2.2.3項下衍生化處理后, 分別吸取5 μl進樣。以色譜峰面積為縱坐標, 對照品濃度為橫坐標, 繪制標準曲線, 計算回歸方程。見表1。

3. 3精密度試驗 取同一批阿膠按“2.2.2”法配制樣品溶液,按“2.2.3”項下衍生化處理后, 吸取5 μl進樣, 重復進樣5次,測定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸的峰面積。結(jié)果RSD分別為1.57%、0.93%、1.92%、1.86%、1.39%、1.87%。試驗結(jié)果表明精密度良好。

3. 4重現(xiàn)性試驗 取同一批阿膠按“2.2.2”法配制樣品溶液5份, 按“2.2.3”項下衍生化處理后, 吸取5 μl, 重復進樣3次, 測定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸的峰面積。結(jié)果RSD分別為1.25%、0.99%、1.37%、1.86%、1.65%、1.86%。試驗結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

3. 5穩(wěn)定性試驗 取阿膠樣品溶液, 衍生化后分別于0、2、4、10、24 h進樣, 每次5 μl, 分別測定峰面積。結(jié)果24 h內(nèi)測得的結(jié)果基本一致。

3. 6回收率實驗 取阿膠粗粉10 mg, 共5份, 按“2.2.1”法配制, 精密加入氨基酸對照品混合溶液10 ml, 按2.2.3項下方法衍生化后得樣品溶液, 測定各氨基酸的含量, 計算回收率。結(jié)果L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酸和精氨酸的平均回收率分別為99.28%、100.17%、98.65%、97.84%、98.47%、97.33% RSD均＜3%。

3. 7樣品含量測定 取6個不同批次的阿膠, 每批3份, 按“2.2.2”法配制, 按“2.2.3”項下衍生化處理得樣品溶液, 按“2.1”色譜條件進行測定, 結(jié)果見表2, RSD為0.8%～2.8%。

表1 6種氨基酸的回歸方程

表2 6批阿膠樣品6種氨基酸含量測定(%, n=3)

4 討論

4. 1氨基酸分析方法有柱前衍生化和柱后衍生化［4］, 因為柱后衍生化需要專門的柱后衍生器, 分析時間也較長。本文采用柱前衍生化測定阿膠中氨基酸含量。因異硫氰酸苯酯(PITC)與氨基酸和亞氨基酸均能反應, 不生成對氨基酸測定有干擾的副產(chǎn)物, 并且生成產(chǎn)物穩(wěn)定, 所以采用PITC衍生化。

4. 2程顯隆等［5］測定阿膠中4種氨基酸含量時柱溫為43℃；謝誼等［6］測定阿膠中17種氨基酸含量采用柱溫為30℃, 本文考察了柱溫為30、31、32、40、41、42、43℃時各氨基酸的分離情況, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)42℃時分離的效果最佳。

近年來, 隨著阿膠價格的上漲, 市場上常有偽品混充,并且制假手段層出不窮, 越來越高明。2010年版《中國藥典》改進了阿膠的含量測定, 要求4種氨基酸的含量為：L-羥脯氨酸≥8.0%, 甘氨酸≥18.0%, 丙氨酸≥7.0%, L-脯氨酸≥10.0%［1］。本文用反相高效液相柱前衍生化測定阿膠中6種主要氨基酸的含量, 不僅符合藥典中4種氨基酸含量的要求, 還測定了另外2種主要氨基酸：谷氨酸、精氨酸的含量,較之藥典更為全面, 并且本方法操作流程簡單、快速、準確,可用于阿膠的質(zhì)量控制。

［1］ 國家藥典委員會.中國藥典.一部, 2010.

［2］ 劉學萍. 阿膠及其偽品的鑒別.中國醫(yī)藥指南, 2010, 8(30): 228-229.

［3］ 霍光華.阿膠氨基酸礦物成分分析與評價.氨基酸和生物資源, 1996, 18(4):22-24.

［4］ 于泓, 牟世芬.氨基酸分析方法的研究進展.分析化學, 2005, 33(3):398.

［5］ 程顯隆, 肖新月, 鄒秦文, 等.柱前衍生化HPLC法同時測定阿膠中4種主要氨基酸的含量.藥物分析雜志, 2008, 28(12): 1997-2000.

［6］ 謝誼, 易艷, 劉陽, 等.柱前衍生HPLC測定阿膠中17種水解氨基酸含量.湖南中醫(yī)藥大學學報, 2012, 5(32):46-49.

Determination of 6 kinds of amino acid content in Ejiao by HPLC method

WANG Cui-fen, LYU Cai-lian, PENG Si-mei, et al. Maoming Petrochemical Hospital, Maoming 525011, China

ObjectiveTo determine content of 6 kinds of amino acids in Ejiao by HPLC method.MethodsThe column was Hypersil C18 (4.6 mm x 250 mm, 5μm); the A of the mobile phase: Acetonitrile -0.1mol/L sodium acetate (7:93), the PH adjusted to 6.5 with acetic acid, the B of the mobile phase: Acetonitrile water (4:1), Gradient elution; the column temperature was 42℃; the flow rate was 1 ml/min; the detection wavelength was 254 nm; Phenyl was othiocyanate (PITC) pre column derivatization.Results6 kinds of amino acids separation completely within 30 minutes; good linear relationship of peak area and concentration, R=0.999, the recovery rate of 97.33%～100.17%, RSD＜3.ConclusionThe HPLC method to determine the content of 6 kinds of amino acids of donkey hide gelatin method of operation is simple, fast, accurate and can be used for quality control and inspection of the preparation.

HPLC; Ejiao; Amino acid; Content

525011 廣東省茂名石化醫(yī)院藥劑科