王敏++++++樸金松++++++高蔚櫻++++++鄭一瑋++++++譚小軍

[摘要] 目的 探討肝細胞癌肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）β-catenin的表達與HCC臨床病理特征的關系。方法 應用Envsion法檢測333例HCC，168例癌旁肝組織及89例正常肝組織的β-catenin表達；RT-PCR檢測37例HCC及癌旁組織，肝癌細胞株HepG2和正常肝細胞株LO2的β-catenin mRNA表達。結果 β-catenin在HCC胞質、胞核的陽性表達率為79%/37%；在癌旁和正常肝組織中的表達率為72%/0%、70%/0%。差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）。且分化好的癌細胞表達低，分化差的細胞表達高。同時，HCC和HepG2的β-catenin mRNA表達高于癌旁組織及LO2的表達。結論 肝細胞癌的β-catenin過表達提示其在癌的發(fā)生過程中可能起著促癌的作用。

[關鍵詞] β-catenin；肝細胞癌；組織芯片；免疫組織化學；RT-PCR

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）13-0031-04

Wnt/β-catenin信號途徑調節(jié)控制著許多生命過程，包括生物體的生長、發(fā)育、疾病、衰老與死亡等。同時，Wnt/β-catenin信號途徑也與腫瘤的發(fā)生密切相關，有十幾種目前已知的高發(fā)性癌變源于Wnt/β-catenin信號轉導途徑的失調[1]。β-catenin是Wnt信號途徑中具轉錄調控活性的關鍵成員，β-catenin能在細胞核內與Wnt途徑的另一類成員LEF1/TCFs 結合從而激活靶基因的轉錄。β-catenin在正常成體細胞胞漿內含量少，而在腫瘤中常出現(xiàn)胞漿內累積和核內表達。因此，本研究擬通過檢測β-catenin在大樣本肝細胞癌病例中的表達，并對其陽性表達與肝細胞癌的臨床病理特征進行分析，探討其在肝細胞癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，以期進一步闡明肝細胞癌的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

石蠟標本：收集廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科1998年1月～2008年1月明確診斷的肝細胞癌標本333例、癌旁肝組織168例及正常肝組織89例。每例患者均登記臨床病理資料，包括年齡、性別、癌灶大小、HBs-Ag 狀態(tài)、有無門靜脈癌栓形成、血清AFP水平，腫瘤分級情況、TMN分期。

組織標本與細胞株：收集廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2010年～2011年外科手術切除的新鮮肝細胞癌組織及其對應的癌旁非腫瘤組織共37例，其中男32例，女5例，年齡25～73歲，平均50.1歲。肝細胞癌細胞株HepG2，肝正常細胞株LO2均為廣州醫(yī)科大學腫瘤研究所保存。

1.2 主要試劑

β-catenin抗體（鼠抗人單克隆抗體，美國Transduction laboratories，clone 14），EnvisionTM試劑盒（K5007）購自DAKO公司；TRIzol Reagent（美國invitrogen），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美國MBI）。

1.3 方法

采用免疫組化Envision法及RT-PCR法進行檢測，具體實驗步驟參照試劑盒說明進行。

1.4 結果判斷

染色結果判斷：β-catenin陽性染色部位為胞膜、胞質和胞核。評分標準采用綜合陽性細胞所占百分比和著色強度進行判斷[2]。陽性細胞著色程度按輕、中及重度染色分別計為1、2、3分。陽性細胞所占百分比積分如下：0分為陽性細胞比例<5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為>76%。然后根據(jù)兩項評分乘積判斷結果。

RNA結果分析：采用圖像分析軟件Gensnap對電泳結果進行半定量分析，計算目的基因和內參基因的灰度比值。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件包進行處理。采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 β-catenin蛋白的表達

β-catenin蛋白在胞膜的陽性表達率是70%（234/333）；在癌旁和正常肝組織的表達率分別是60%（100/168）和65%（58/89）。β-catenin在非癌組織中的膜表達低于在癌組織中的膜表達（封三圖4A、C、D）。經(jīng)統(tǒng)計學分析，肝細胞癌中β-catenin膜的表達與在非腫瘤組織中膜的表達兩兩比較有顯著性差異（癌旁，P=0.000；正常肝組織，P=0.000）； β-catenin胞質的陽性表達率是79%（262/333）；在癌旁和正常肝組織中的表達率分別是72%（122/168）和70%（62/89）。β-catenin在非癌組織中的胞質表達低于在癌組織中的表達（封三圖4A、C、D）。經(jīng)統(tǒng)計學分析，肝細胞癌中β-catenin胞質的表達與在非腫瘤組織中胞質的表達兩兩比較有顯著性差異（癌旁，P=0.000； 正常肝組織，P=0.000）； β-catenin蛋白在胞核的陽性表達率是37%（123/333），在非癌組織中無核表達（封三圖4B）。經(jīng)統(tǒng)計學分析，肝細胞癌中β-catenin胞核表達與在非腫瘤組織中核表達兩兩比較有顯著性差異（癌旁，P=0.000； 正常肝組織，P=0.000）。

2.2 β-catenin mRNA的表達

本實驗檢測了37例肝細胞癌及對應的癌旁非腫瘤組織中β-catenin mRNA的表達。β-catenin mRNA在癌旁非腫瘤組織的表達明顯低于其在肝細胞癌組織中的表達（圖1）。經(jīng)統(tǒng)計學分析，β-catenin mRNA在肝細胞癌組織和癌旁非腫瘤組織中的表達量有顯著性差異（P=0.001）。本實驗也檢測了β-catenin mRNA在肝癌細胞株HepG2和正常肝細胞株LO2的表達。β-catenin mRNA在HepG2的表達明顯高于其在LO2的表達（圖1）。

A：肝細胞癌（T）及對應的癌旁非腫瘤組織（P）中β-catenin mRNA的表達；B：1.正常肝細胞株LO2中未檢測出β-catenin mRNA的表達；2.肝細胞癌細胞株HepG2中β-catenin mRNA 過表達

圖1 β-catenin mRNA的表達

2.3 β-catenin蛋白的表達與肝細胞癌臨床病理參數(shù)的關系

β-catenin胞質表達與腫瘤細胞分化密切相關（P=0.031），隨著細胞的分化程度降低而增加。與年齡、性別、AFP值、腫瘤大小、HBs-Ag 感染、門靜脈癌栓和TNM分期無統(tǒng)計學意義。β-catenin蛋白核表達與HBV 感染密切相關（強度，P=0.028；百分比，P=0.026），與細胞分化程度相關（P=0.023），β-catenin蛋白核表達隨著細胞分化程度的降低而增加。與年齡、性別、AFP值、腫瘤大小、門靜脈癌栓和TNM分期比較，差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

3 討論

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率地區(qū)差異很大，常見于亞洲和非洲國家。HCC的發(fā)生是一個多階段、多因素協(xié)同作用，經(jīng)過啟動、促癌和演進等多步驟過程以及多個癌基因和相關基因參與、多個基因發(fā)生突變的結果。有研究顯示，β-catenin基因外顯子3突變在肝癌中是頻發(fā)事件，可達62.5%，其突變可使β-catenin穩(wěn)定化，促進肝癌的發(fā)生[3]。

正常情況下β-catenin主要與細胞膜上E-cadherin結合參與細胞黏附作用，細胞內的β-catenin與糖原合成酶激酶3（GSK-3），結直腸腺瘤息肉蛋白（APC）和軸蛋白（Axin）結合，形成多聚蛋白復合體。并在APC和GSK-3β等作用下很快降解，不會形成聚集。當Wnt蛋白與胞膜受體結合后抑制GSK-3激活，阻止β-catenin多聚蛋白復合體的形成，β-catenin降解減少從而進入細胞核內形成β-catenin-Tcf/Lef復合體，調控下游靶基因的表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。如乳腺癌、食管癌、結直腸癌、惡性黑色素瘤、白血病、前列腺癌、子宮內膜癌、原發(fā)性肝癌、甲狀腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中都有Wnt/β-catenin通路異常[4]。

Lai等[5]研究結果顯示β-catenin mRNA在肝細胞癌中的表達明顯高于癌旁肝組織，免疫組化結果亦顯示β-catenin異常累積出現(xiàn)在肝細胞癌細胞胞核中； Austinat等[6]的研究顯示，在53例肝細胞癌標本中有42例呈胞質/胞核陽性表達；Inagawa的研究亦表明[7]β-catenin 在肝癌中呈局部或廣泛核內表達，其核陽性表達率達35.3%，在癌旁非腫瘤組織中無胞核表達。Higgs MR等[8]的研究顯示HCV型肝炎病毒誘導活化的β-catenin促進c-Myc基因的表達，表明β-catenin與HCV相關肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。Evason KJ等[9]研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在非典型肝細胞腺瘤樣腫瘤與高分化肝細胞癌中的激活都有相似的形態(tài)學和細胞遺傳學的改變，提示β-catenin在肝細胞癌發(fā)生的早期發(fā)生改變。本實驗結果顯示，β-catenin在癌旁肝組織和正常肝組織中中主要聚集在肝細胞膜，在大樣本肝細胞癌組織中β-catenin胞質/核表達明顯升高，核表達陽性率為37%。RT-PCR結果顯示β-catenin mRNA在癌組織表達高，在非腫瘤組織中表達低；在肝癌細胞株HepG2表達高，在正常肝細胞株LO2表達低。與王啟明等[10]的研究結果一致，亦提示β-catenin的激活與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切關系。

HCC的眾多臨床病理參數(shù)都與其生物學行為或預后存在著一定的聯(lián)系。徐兵等[11]研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin的異位表達與腫瘤的分級密切相關。本研究結果顯示，β-catenin胞質/核的表達與腫瘤細胞分化程度和HBs-Ag狀態(tài)（status）顯著相關；β-catenin在分化差的細胞質/核表達高，分化好的細胞質/核表達低。β-catenin作為Wnt/β-catenin通路的關鍵成員，對細胞的分化有重要影響。Witjes CD等[12]研究表明β-catenin蛋白在胞質和核內的積聚與肝細胞癌細胞分化相關，低分化細胞表達升高，高分化細胞中減低。因此，本研究結果提示β-catenin蛋白的異常積聚過程伴隨著細胞分化程度的降低，參與了肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展。

[參考文獻]

[1] Surana R，Sikka S，Cai W，et al. Secreted frizzled related proteins： Implications in cancers[J]. Biochim Biophys Acta，2013，1845（1）：53-65.

[2] Chengquan Z，Ross B，Russell V，et al. Diagnostic utility of WT1 immunostaining in ovarian sertoli cell tumor[J]. Am J Surg Pathol，2007，31：1378-1384.

[3] Lachenmayer A，Alsinet C，Savic R，et al. Wnt-pathway activation in two molecular classes of hepatocellular carcinoma and experimental modulation by sorafenib[J]. Clin Cancer Res，2012，18（18）：4997-5007.

[4] Klaus A，Birchmeier W. Wnt signalling and its impact on development and cancer[J]. Nat Rev Cancer，2008，8（5）：387-398.

[5] Lai TY，Su CC，Kuo WW，et al. β-catenin plays a key role in metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2011，26（2）：415-422.

[6] Austinat M，Dunsch R，Gaunitz F，et al. Correlation between beta-catenin mutations and expression of Wnt-signaling target genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer，2008，7（21）：1-9.

[7] Inagawa S，Itabashi M，F(xiàn)ukao K，et al. Expression and prognostic roles of β-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8（2）：450-456.

[8] Higgs MR，Lerat H，Pawlotsky JM. Hepatitis C virus-induced activation of β-catenin promotes c-Myc expression and a cascade of pro-carcinogenetic events[J]. Oncogene，2013，32（39）：4683-4693.

[9] Evason KJ，Grenert JP，F(xiàn)errell LD， et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol，2013，44（5）：750-758.

[10] 王啟明，賈連群，周鴻鷹，等. Wnt/β-catenin 信號因子在HepG2以及LO2細胞中的表達[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2007，32（8）：826-829.

[11] 徐兵，羅慶豐，江凌玲，等. 肝細胞肝癌β-catenin的表達與臨床病理特征的關系[J].江西醫(yī)藥，2011，46（12）：1072-1074.

[12] Witjes CD， Ten Kate FJ， Verhoef C， et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol，2013，66（8）：687-691.

（收稿日期：2013-11-06）

[5] Lai TY，Su CC，Kuo WW，et al. β-catenin plays a key role in metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2011，26（2）：415-422.

[6] Austinat M，Dunsch R，Gaunitz F，et al. Correlation between beta-catenin mutations and expression of Wnt-signaling target genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer，2008，7（21）：1-9.

[7] Inagawa S，Itabashi M，F(xiàn)ukao K，et al. Expression and prognostic roles of β-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8（2）：450-456.

[8] Higgs MR，Lerat H，Pawlotsky JM. Hepatitis C virus-induced activation of β-catenin promotes c-Myc expression and a cascade of pro-carcinogenetic events[J]. Oncogene，2013，32（39）：4683-4693.

[9] Evason KJ，Grenert JP，F(xiàn)errell LD， et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol，2013，44（5）：750-758.

[10] 王啟明，賈連群，周鴻鷹，等. Wnt/β-catenin 信號因子在HepG2以及LO2細胞中的表達[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2007，32（8）：826-829.

[11] 徐兵，羅慶豐，江凌玲，等. 肝細胞肝癌β-catenin的表達與臨床病理特征的關系[J].江西醫(yī)藥，2011，46（12）：1072-1074.

[12] Witjes CD， Ten Kate FJ， Verhoef C， et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol，2013，66（8）：687-691.

（收稿日期：2013-11-06）

[5] Lai TY，Su CC，Kuo WW，et al. β-catenin plays a key role in metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep，2011，26（2）：415-422.

[6] Austinat M，Dunsch R，Gaunitz F，et al. Correlation between beta-catenin mutations and expression of Wnt-signaling target genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer，2008，7（21）：1-9.

[7] Inagawa S，Itabashi M，F(xiàn)ukao K，et al. Expression and prognostic roles of β-catenin in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2002，8（2）：450-456.

[8] Higgs MR，Lerat H，Pawlotsky JM. Hepatitis C virus-induced activation of β-catenin promotes c-Myc expression and a cascade of pro-carcinogenetic events[J]. Oncogene，2013，32（39）：4683-4693.

[9] Evason KJ，Grenert JP，F(xiàn)errell LD， et al. Atypical hepatocellular adenoma-like neoplasms with β-catenin activation show cytogenetic alterations similar to well-differentiated hepatocellular carcinomas[J]. Hum Pathol，2013，44（5）：750-758.

[10] 王啟明，賈連群，周鴻鷹，等. Wnt/β-catenin 信號因子在HepG2以及LO2細胞中的表達[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2007，32（8）：826-829.

[11] 徐兵，羅慶豐，江凌玲，等. 肝細胞肝癌β-catenin的表達與臨床病理特征的關系[J].江西醫(yī)藥，2011，46（12）：1072-1074.

[12] Witjes CD， Ten Kate FJ， Verhoef C， et al. Immunohis to chemical characteristics of hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic livers[J]. J Clin Pathol，2013，66（8）：687-691.

（收稿日期：2013-11-06）