劉 軍 曹建剛 姚慶斌 李稚君1， 付 鑫 馬信龍，4△

鈣敏感受體在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)研究

劉 軍1，2曹建剛1，2姚慶斌3李稚君1，3付 鑫2馬信龍1，2，4△

目的 研究鈣敏感受體(CaSR)在人骨性關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨中的表達(dá)強(qiáng)度，探討其與OA發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。方法收集5例因膝關(guān)節(jié)OA接受全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端標(biāo)本，HE染色后根據(jù)Collins病理學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨退變分級，Collins 0級切片8張為軟骨正常組，CollinsⅡ級切片8張為軟骨退變組，免疫組織化學(xué)染色后比較2組軟骨組織內(nèi)CaSR的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果CaSR在OA軟骨中陽性表達(dá)，CaSR在軟骨正常組的表達(dá)強(qiáng)度低于退變軟骨組（評分：1.63±0.95 vs 3.52±0.78，t=8.99，P＜0.05）。結(jié)論CaSR活化與關(guān)節(jié)軟骨退變有關(guān)。

骨性關(guān)節(jié)炎；膝關(guān)節(jié)；軟骨細(xì)胞；鈣敏感受體；免疫組織化學(xué)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種發(fā)病率很高的以軟骨退行性變和繼發(fā)骨質(zhì)增生為主的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，多見于中老年人。臨床以關(guān)節(jié)軟骨損壞為主要病理特征，常影響患者的肢體功能和日常生活，嚴(yán)重時甚至造成關(guān)節(jié)殘疾?；颊哧P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡是造成軟骨變性的重要原因之一。Yamaguchi等[1]發(fā)現(xiàn)在骨組織微環(huán)境中，軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中鈣敏感受體(CaSR)的活化能夠促進(jìn)骨重建過程，但其與OA軟骨的關(guān)系尚未明確。本研究通過觀察CaSR在膝關(guān)節(jié)OA軟骨組織中的表達(dá)水平，探討其在OA中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取在我院接受全膝關(guān)節(jié)置換的患者5例，其中女4例，男1例，年齡58～71歲，平均（65.40±5.32）歲；病史5.5～20.0年，平均（12.70±5.43）年。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會提出的骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007版）中骨關(guān)節(jié)炎的診斷依據(jù)，并經(jīng)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中證實。（2）無心血管、肝、腎等重要臟器病變。（3）術(shù)前4周未使用非甾體類抗炎藥、皮質(zhì)醇等。排除類風(fēng)濕、感染性關(guān)節(jié)炎等其他關(guān)節(jié)疾患者。

1.2 主要試劑及耗材 CaSR抗體（Sigma公司），即用型高效免疫組化二抗試劑盒（優(yōu)寧維生物公司），乙醇、二甲苯、PBS緩沖液、蒸餾水、防脫玻片、蓋玻片、顯微鏡等由天津醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎學(xué)教研室提供。

1.3 實驗方法 將全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中所取軟骨及含軟骨下骨標(biāo)本用生理鹽水沖洗后，肉眼初步篩選出軟骨表面光滑的輕、中度退變組織塊，切成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm小塊，用體積分?jǐn)?shù)為10％的福爾馬林固定，自動脫水機(jī)脫水(全程14 h)，58～60℃石蠟包埋，5例膝關(guān)節(jié)標(biāo)本共制作蠟塊24枚，垂直于關(guān)節(jié)軟骨切取5 μm厚組織切片。對組織切片進(jìn)行HE染色后，根據(jù)Collins病理學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)將關(guān)節(jié)軟骨退變分級如下[2]：0級為關(guān)節(jié)軟骨正常，軟骨細(xì)胞分布均勻。Ⅰ級為軟骨淺表可見切線裂隙。Ⅱ級為縱行裂隙形成，軟骨細(xì)胞增殖并呈簇狀排列。Ⅲ級為深部裂隙形成，裂隙累及軟骨全層深達(dá)鈣化帶，軟骨剝脫，深部偶見少量軟骨細(xì)胞增殖呈簇狀排列。Ⅳ級為侵蝕軟骨下組織，軟骨完全剝脫，軟骨下骨暴露，見明顯骨贅。選取Collins 0級切片8張標(biāo)記為軟骨正常組，CollinsⅡ級切片8張標(biāo)記為軟骨退變組，分別對2組源蠟塊再次切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，按二步法免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，然后鏡下觀察。

1.4 免疫組化染色結(jié)果判定 采用半定量積分法對每張切片的陽性細(xì)胞率及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行分級記分，然后根據(jù)兩項之和確定其陽性強(qiáng)度[3]。陽性細(xì)胞率即陽性細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞的比例，每張切片計數(shù)5個400倍視野細(xì)胞：陽性細(xì)胞率10％為0分；10％～25％為1分；25.1％～50％為2分；50.1％～70％為3分；70.1％～100％為4分。陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度：僅細(xì)胞核藍(lán)色者為陰性，細(xì)胞漿棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性。陰性(-)為0分，弱陽性(+)為1分，陽性(++)為2分，強(qiáng)陽性(+++)為3分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 軟骨正常組關(guān)節(jié)軟骨基本正常，軟骨細(xì)胞排列均勻，見圖1；Ⅰ級切片5張，軟骨表面見微小切線裂隙，少量簇聚的軟骨細(xì)胞；Ⅱ級切片8張，可見軟骨縱行裂隙形成，軟骨細(xì)胞增生并呈簇狀排列，見圖2；Ⅲ級切片2張，軟骨深部裂隙形成，裂隙達(dá)鈣化帶（潮線），偶見簇聚軟骨細(xì)胞；Ⅳ級切片1張，可見軟骨下組織侵蝕，軟骨剝脫、缺失，軟骨下骨暴露，軟骨細(xì)胞少，排列凌亂，基質(zhì)染色不均勻。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 CaSR在膝OA軟骨中陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞染色位于軟骨細(xì)胞胞漿中，分布密集呈棕黃色顆粒狀，在OA退變期軟骨細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度明顯增高。CaSR在膝關(guān)節(jié)退變軟骨(Collins病理分級Ⅱ級)中存在較高強(qiáng)度的表達(dá)，見圖3；在正常膝關(guān)節(jié)軟骨（Collins病理分級0級）中表達(dá)較少或無表達(dá)，見圖4。CaSR在軟骨正常組的表達(dá)強(qiáng)度低于軟骨退變組（評分：1.63±0.95 vs 3.52±0.78，t=8.99，P＜0.05）。

3 討論

OA是一種最為常見的非炎性滑膜關(guān)節(jié)疾病，目前對該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞的凋亡過度是關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)展成OA的重要原因[4]。CaSR是G蛋白偶聯(lián)受體的C家族成員，由氨基胞外域、7個跨膜螺旋的跨膜域和胞內(nèi)羧基尾部組成。CaSR主要分布在參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的甲狀旁腺、胃腸道、骨組織和腎組織以及其他細(xì)胞（如中樞和外周神經(jīng)、肝臟，血細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞等），其功能主要是維持Ca2+和其他金屬離子穩(wěn)態(tài)，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、離子通道開啟、激素分泌等[5-6]。動物實驗研究證實OA軟骨組織中存在CaSR的表達(dá)，且軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中CaSR的活化能促進(jìn)骨重建過程[1，7]。為進(jìn)一步證實人OA軟骨與CaSR之間的關(guān)系，本研究通過免疫組織化學(xué)方法證實了人OA軟骨中存在CaSR的表達(dá)，且其表達(dá)強(qiáng)度與軟骨退變程度相關(guān)。CaSR在Collins病理分級為Ⅱ級軟骨中的表達(dá)顯著高于0級的軟骨組織，但由于本研究排除了軟骨細(xì)胞較少的Ⅲ級、Ⅳ級軟骨組織切片，所以并不能證實OA中CaSR與軟骨退變程度存在正相關(guān)。

國內(nèi)外目前關(guān)于CaSR在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)機(jī)制的研究較少，尤其是在人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退變病理過程中CaSR的功能表達(dá)及其病理生理意義報道更少。盡管研究已證實，在成骨細(xì)胞中CaSR可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及礦化作用；而在破骨細(xì)胞中，CaSR可引起細(xì)胞分化和凋亡[8-9]。但由于關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，與骨代謝有所不同，軟骨細(xì)胞通過分解代謝和合成代謝的細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)保持微環(huán)境的平衡。根據(jù)軟骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能，可以把細(xì)胞因子分為分解代謝的細(xì)胞因子，包括：白細(xì)胞介素（IL）-1，腫瘤壞死因子（TNF）-α，IL-17，IL-18等；合成代謝的細(xì)胞因子，包括：胰島素樣生長因子（IGF）1，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）2、4、6等[10]。因此以后研究CaSR在OA軟骨組織中的作用可圍繞與OA相關(guān)的細(xì)胞因子展開。

Fig.1 HE staining showed Collins grade 0,structural integrity of cartilage,evenly distributed chondrocytes(×100)圖1 HE染色后Collins病理分級0級，軟骨結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞均勻分布(×100)

Fig.2 HE staining showed Collins gradeⅡ,fissures formed in deep of cartilage,cartilage cells arranged in clusters(×100)圖2 HE染色后Collins病理分級Ⅱ級，可見軟骨深部裂隙形成，軟骨細(xì)胞成簇排列(×100)

Fig.3 CaSR showed brown granular cytoplasm in the articular chondrocytes of knee OA of Collins gradeⅡ(×400)圖3 CaSR在膝OA Collins病理分級Ⅱ級的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞漿中呈棕黃色顆粒狀(×400)

Fig.4 CaSR weakly expressed in the articular chondrocytes of knee OA of Collins grade 0(×400)圖4 CaSR在膝OA Collins病理分級0級的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞漿中僅見弱表達(dá)(×400)

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（2014-01-12收稿 2014-04-25修回）

（本文編輯 閆娟）

The Expression of Calcium-Sensing Receptor in Human Osteoarthritis Cartilage

LIU Jun1,2,CAO Jiangang1,2，YAO Qingbin3，LI Zhijun1,3，F(xiàn)U Xin2，MA Xinlong1,2,4△
1 General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China;2 Department of Joint Surgery,Tianjin Hospital; 3 Basic Medical College of Tianjin Medical University;4 Tianjin Institute of Integrative Medicine Orthopedics,Tianjin Hospital△

E-mail：maxinlong8686@sina.com

ObjectiveTo investigate calcium-sensing receptor(CaSR)expression level in osteoarthritis(OA)cartilage，and the relationship with OA pathogenesis thereof.MethodsThe degenerated human cartilage of distal femur and proximal tibia came from 5 patients with OA underwent total knee replacement surgery.The tissue specimens were stained by HE.According to the Collins histological grading standards,articular cartilage degeneration was classificated in specimens.Eight HE slices of Collins grade 0 were used as normal cartilage group.Eight HE slices of Collins gradeⅡwere used as degeneration cartilage group.The CaSR expression levels detected by immunohistochemical staining technique were compared between two groups.ResultsExpression of CaSR was detected in osteoarthritis cartilage.The expression intensity of CaSR was significantly lower in normal cartilage group than that of degeneration of cartilage group(score：1.63±0.95 vs 3.52± 0.78，t=8.99，P＜0.05).ConclusionThe activation of CaSR is associated with the degeneration of articular cartilage.

osteoarthritis；knee；chondrocyte；calcium-sensing receptor；immunohistochemistry

R684.3

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.018

天津市衛(wèi)生局科技基金重點項目（2013kz063）

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科（郵編300052）；天津市天津醫(yī)院關(guān)節(jié)外科；3天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4天津醫(yī)院、天津市中西醫(yī)結(jié)合骨科研究所

△通訊作者 E-mail：maxinlong8686@sina.com