李 楊秦 勤△ 任 蓓趙麗麗毛用敏鄭 萍

原發(fā)性高血壓患者血清脂聯素及其基因多態(tài)性與冠心病的相關性研究

李 楊1秦 勤1△任 蓓1趙麗麗1毛用敏2鄭 萍1

目的 探討原發(fā)性高血壓患者血清脂聯素水平及其基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262與冠心病及冠脈病變程度的關系。方法以高血壓患者414例（其中單純高血壓患者180例，高血壓合并冠心病患者234例）和正常對照組185例為研究對象，應用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清脂聯素水平，聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法檢測脂聯素rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262位點多態(tài)性。結果高血壓合并冠心病組脂聯素水平較對照組和單純高血壓組顯著降低。脂聯素rs7649121位點雜合子AT基因型較AA基因型可降低冠心病風險（校正OR=0.566，95％CI 0.346～0.925，P=0.023）。多元Logistic回歸分析顯示年齡、LDL-C為冠心病的危險因素，脂聯素為冠心病的保護因素。隨著病變支數增加，脂聯素水平呈逐漸降低趨勢。脂聯素SNP位點基因型對血清脂聯素水平無明顯影響。結論脂聯素水平降低是高血壓患者發(fā)生冠心病的獨立危險因素，且隨著冠脈病變程度的加重，脂聯素水平逐漸降低。脂聯素rs7649121位點多態(tài)性可能與高血壓患者并發(fā)冠心病有關。

脂聯素；多態(tài)性,單核苷酸；高血壓；冠心?。籐ogistic模型

脂聯素（adiponectin,APN）是一種脂肪細胞分泌的特異性細胞因子，研究表明脂聯素與胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化等密切相關[1]。冠心病是高血壓患者最常見的靶器官損害之一，用遺傳學方法從原發(fā)性高血壓人群中篩選出冠心病的易感基因，將有助于預防此人群冠心病的發(fā)生。本研究通過檢測天津地區(qū)高血壓患者血清脂聯素水平及其4個基因位點 rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262的單核苷酸多態(tài)性（SNP），探討脂聯素及其基因多態(tài)性與高血壓患者并發(fā)冠心病的關系，以及兩者對冠脈病變程度的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2010年8月—2011年11月于我院心內科住院的高血壓患者414例，根據是否合并有冠心病分為：單純高血壓組180例，年齡42～77歲，平均(58.82±7.82)歲，其中男93例，女87例；高血壓合并冠心病組234例，年齡30～78歲，平均(59.87±9.12)歲，男123例，女111例。高血壓采用世界衛(wèi)生組織-國際高血壓聯盟（WHO-ISH）的診斷標準，即收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg，或既往有高血壓病史，目前正在服用降壓藥物治療的患者。冠心病患者符合1979年WHO診斷標準，并經冠狀動脈造影證實主要冠狀動脈血管（左前降支、左回旋支、右冠狀動脈）至少有1支狹窄≥50％。選擇同期住院的無高血壓病史且血壓正常患者185例為對照組，并經心電圖、血液檢查、心臟超聲及冠脈造影檢查除外心臟疾病。所有受試者均排除嚴重肝、腎疾病及急、慢性感染性疾病、甲狀腺功能亢進或減退、全身大動脈疾病、結締組織病、各種腫瘤及繼發(fā)性高血壓患者。

1.2 冠狀動脈造影 采用Judkins法行冠狀動脈造影，每支血管選擇多體位投照，以國際通用的直徑法由2名有經驗的醫(yī)師對造影結果進行分析。若前降支、回旋支或右冠狀動脈中1支狹窄者歸為單支病變，2支狹窄者歸為雙支病變，3支狹窄者歸為3支病變。對于左主干病變，無論前降支、回旋支有無狹窄均歸為雙支病變。

1.3 生化指標測定 患者入院后空腹12 h采取肘正中靜脈血，分離血清，采用競爭性酶聯免疫吸附法（ELISA）測定脂聯素水平，按照試劑盒說明書進行（RapidBio Lab，California，USA）。血總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）、空腹血糖（FPG）等生化指標采用全自動生化分析儀測定。

1.4 基因型分析 取靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，分離白細胞，采用苯酚-氯仿抽提法提取基因組DNA。應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法檢測脂聯素基因rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262位點SNP。相應引物序列見表1，由北京奧科生物技術有限公司合成。反應體系10 μL，PCR反應條件：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，55.2℃（rs266729、rs7649121）或58.5℃（rs1501299）或52.5℃（rs3774262）退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次后72℃再延伸8 min?；虍a物經限制性內切酶HhaⅠ(rs266729)，BsmⅠ（rs1501299），EarⅠ（rs7649121，rs3774262）酶切后，經1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離觀察基因型，凝膠分析儀照相并記錄結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，計數資料比較采用χ2檢驗，各變量與冠心病的關系采用多元二項式Logistic回歸分析。應用THESIAS軟件進行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗和單倍型分析。雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組間一般臨床資料及脂聯素水平比較 3組間性別、年齡、吸煙史及VLDL-C水平差異無統計學意義，高血壓合并冠心病組TC、TG、LDL-C及FPG水平較對照組和單純高血壓組顯著升高（P＜0.05），HDL-C及APN水平較對照組和單純高血壓組顯著降低(P＜0.05)，見表2。

2.2 脂聯素SNP位點基因型及等位基因分布頻率比較 脂聯素SNP rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262基因型分布頻率在3組中均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2分別為0.781、0.163、0.522、0.896、0.009、0.083、1.360、1.560、0.203、1.682、1.170、0.242，均P＞0.05），說明本研究人群具有群體代表性。rs266729等位基因頻率，rs7649121基因型頻率，rs1501299和rs3774262的基因型頻率及等位基因頻率在3組間分布差異有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

2.3 高血壓患者脂聯素基因多態(tài)性與冠心病的關系 在高血壓患者中rs7649121位點雜合子AT基因型較純合子AA基因型可降低冠心病風險，且這種影響在校正性別、年齡、BMI、糖尿病史、吸煙史、血脂、血糖等冠心病傳統危險因素后依然存在。rs3774262位點AA基因型較GG基因型或AG/GG基因型可降低冠心病風險，但這種影響在校正冠心病傳統危險因素后消失；其他2個SNP位點與冠心病無明顯相關性，見表4。

Tab.1 The PCR primer sequences and the length of enzyme-digested products表1 SNP位點所用引物及酶切產物長度

2.4 高血壓患者并發(fā)冠心病的多因素回歸分析 以冠心病為因變量，以性別、年齡、BMI、吸煙史、糖尿病史、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FPG、APN及rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262這 4個位點的基因多態(tài)性為自變量，進行多元二項式Logistic回歸分析，結果顯示年齡、LDL-C為冠心病的危險因素，脂聯素為冠心病的保護因素，見表5。

2.5 病變支數與脂聯素及其基因多態(tài)性的關系 隨著冠脈病變支數的增加，脂聯素水平逐漸降低，差異有統計學意義；不同冠脈病變支數間脂聯素SNP位點基因型分布無明顯差異，見表6。

2.6 脂聯素基因多態(tài)性對脂聯素水平的影響 脂聯素SNPrs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262位點不同基因型間脂聯素水平差異無統計學意義，見表7。

2.7 單體型分析 脂聯素 SNP rs266729(C＞G)、rs7649121(A＞T)、rs1501299(G＞T)、rs3774262(G＞A)單體型在冠心病組及對照組間分布差異無統計學意義，見表8。

Tab.2 Comparison of clinical data and APN levels between three groups表2 各組臨床資料及脂聯素水平比較

Tab.3 Comparison of SNP genotype and allele frequency between three groups表3 脂聯素SNP位點基因型及等位基因在各組間分布頻率比較 例（％）

3 討論

脂聯素是由脂肪細胞分泌的在脂肪組織中含量最為豐富的基因轉錄產物，是脂肪細胞因子家族的重要成員之一。研究證實，脂聯素具有抗動脈粥樣硬化形成、抗炎癥和抗內膜增生等特性，可能與糖尿病、代謝綜合征、冠心病等發(fā)病有關[1]。長期高血壓是促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。有研究發(fā)現，高血壓患者的血漿脂聯素水平明顯減低，并且隨著血壓水平的升高，脂聯素水平逐漸下降[2]。多項研究證實，低脂聯素血癥是冠心病的獨立危險因素之一[3-4]。本研究中高血壓合并冠心病組患者脂聯素水平明顯降低，且隨著病變支數的增加脂聯素水平呈逐漸下降的趨勢，Logistic回歸分析顯示低脂聯素血癥為高血壓患者發(fā)生冠心病的危險因素，證實了脂聯素在高血壓患者發(fā)生動脈粥樣硬化的過程中發(fā)揮重要作用，兩種疾病的疊加進一步促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，脂聯素可以作為反映冠脈病變嚴重程度的一個輔助指標，以脂聯素為干預靶點的治療可能為高血壓患者的一級預防提供新的思路。

編碼脂聯素的基因位于染色體3q27區(qū)域，為2型糖尿病、代謝綜合征及冠心病的易感位點，有較大頻率的基因多態(tài)性[5]，其SNP可能通過影響血清脂聯素水平而參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。國內外已有大量研究結果顯示在不同種族人群中脂聯素基因多態(tài)性與疾病的相關性不盡相同。國外有研究發(fā)現，脂聯素基因SNP+276 G/T（rs1501299）多態(tài)性只增加早發(fā)冠心病患者的危險性,在晚發(fā)冠心病患者中起決定作用的則是其他的心血管危險因素[6]。rs1501299 T等位基因攜帶者心肌梗死風險增高[7]。國內亦有研究發(fā)現rs1501299 G＞T突變增加冠心病風險，但對脂聯素水平無明顯影響[8]。也有研究顯示rs1501299 G等位基因與冠心病風險增高有關[9-10]。亦有研究表明，SNP+276G/T與冠狀動脈疾病的發(fā)生及血漿APN水平不相關[11]。大規(guī)模的薈萃分析提示rs1501299 T等位基因降低心血管病風險[12-13]。有關rs266729的研究結果也不一致，有研究提示rs266729 G等位基因增加心血管病風險[13]，薈萃分析顯示rs266729與心血管疾病之間的相關性僅在亞洲人群中是顯著的[13-14]。有研究顯示rs7649121與糖尿病及代謝綜合征相關[15-16]，但rs7649121及rs3774262位點與冠心病的相關性，目前國內外尚鮮見到報道。本研究中脂聯素rs7649121位點雜合子AT基因型較純合子AA基因型可降低高血壓患者冠心病風險，rs266729、rs1501299、rs3774262則與冠心病無明顯相關性，可能與人群種族差異及本研究樣本量較小有關。

Tab.4 Effects of adiponectin gene polymorphism on risk factors of coronary artery disease in hypertension patients表4 脂聯素基因多態(tài)性對高血壓患者并發(fā)冠心病風險的影響

Tab.5 Logistic regression analysis of risk factors for coronary artery disease表5 冠心病影響因素分析

綜上，脂聯素作為一個脂肪細胞分泌的細胞因子，是連接代謝紊亂與心血管疾病的重要環(huán)節(jié)，高血壓合并低脂聯素血癥患者可能更易于發(fā)生心血管疾病，早期監(jiān)測高血壓患者的脂聯素水平，并以其為治療靶點可能成為高血壓患者一級預防與二級預防的重要措施。脂聯素基因SNP與冠心病的相關性尚需進一步大樣本研究加以證實。

Tab.6 Relationship between adiponectin gene polymorphism and serum adiponectin levels with the severity of coronary artery stenosis表6 病變支數與脂聯素及其基因多態(tài)性的關系

Tab.7 Comparison of serum adiponectin levels in different genotype groups表7 不同基因型脂聯素水平比較

Tab.8 Haplotype analysis of APN SNPs表8 脂聯素SNP位點單體型分析

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（2014-02-26收稿 2014-05-23修回）

（本文編輯 李國琪）

The Association between Serum Adiponectin Levels and Gene Polymorphism with Coronary Artery Disease in Patients with Essential Hypertension

LI Yang1，QIN Qin1△，REN Bei1，ZHAO Lili1，MAO Yongmin2，ZHENG Ping1
1 Department of Cardiology，Tianjin Chest Hospital，Tianjin 300222，China；2 Tianjin Institute of Cardiovascular Disease△

E-mail:qinqin6351@163.com

ObjectiveTo observe the association between adiponectin gene polymorphism,serum adiponectin levels with the incidence of coronary artery disease(CAD)and the severity of coronary artery stenosis in patients with essential hypertension(EH).MethodsA total of 414 patients with EH(234 cases with CAD and 180 cases without CAD)and 185 control subjects were recruited in this study.Serum adiponectin levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Adiponectin single-nucleotide polymorphisms rs266729，rs7649121，rs1501299 and rs3774262 were genotyped by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).ResultsSerum adiponectin levels were significantly lower in EH with CAD group than those in control group and EH without CAD group.Adiponectin SNP rs7649121 AT genotype reduced the risk of CAD compared with AA genotype(adjusted OR=0.566，95％CI 0.346-0.925，P=0.023).Logistic regression analysis showed that age and LDL-C were risk factors of CAD,and adiponectin was the protective factor for CAD in EH patients.The severity of coronary artery stenosis was negatively related to the level of adiponectin.Adiponectin levels were not affected by the adiponectin gene polymorphism.ConclusionThe decreased serum adiponectin level was the independent risk factor for CAD in EH patients,which was negatively related to the severity of coronary artery stenosis.Adiponectin SNP rs7649121 may contribute to the risk factors of CAD in EH patients.

adiponectin;polymorphism,single nucleotide;hypertension;coronary disease;Logistic models

R541

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.014

天津市衛(wèi)生局科技基金項目（2006KR11）

1天津市胸科醫(yī)院心內科（郵編300222）；2天津市心血管病研究所

△通訊作者 E-mail:qinqin6351@163.com