宋 恩 李光第 周如丹 趙學(xué)凌

細(xì)胞與分子生物學(xué)

MCP-1轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)/沉默后相關(guān)信號(hào)通路研究

宋 恩 李光第 周如丹 趙學(xué)凌△

目的 探討單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)/沉默后相關(guān)信號(hào)通路與深靜脈血栓形成的關(guān)系。方法培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞行免疫熒光、免疫共沉淀檢測(cè)，構(gòu)建人MCP-1細(xì)胞系過表達(dá)/沉默載體，基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)人MCP-1細(xì)胞系過表達(dá)/沉默后轉(zhuǎn)錄譜變化并行生物信息技術(shù)分析。結(jié)果培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；構(gòu)建人MCP-1過表達(dá)/干擾載體MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP shRNAmir1經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后感染HUVECs；基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比，過表達(dá)載體MCP-1-pCDH-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞有18條信號(hào)通路下調(diào)，7條信號(hào)通路上調(diào)；干擾載體MCP-1-LMP shRNAmir1轉(zhuǎn)染細(xì)胞有60條信號(hào)通路下調(diào)，15條信號(hào)通路上調(diào)。結(jié)論MCP-1轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后相關(guān)信號(hào)通路為深靜脈血栓疾病分子層面研究提供新的思路，MCP-1可能在深靜脈血栓形成發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

單核細(xì)胞；趨化因子類；內(nèi)皮，血管；臍靜脈；信號(hào)傳導(dǎo)；靜脈血栓形成；單核細(xì)胞趨化蛋白-1；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）屬于趨化因子家族CC亞族成員，該亞族主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生。MCP包括MCP-l、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5[1]。MCP-l主要由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等分泌與釋放。MCP-1具有誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞趨化和激活單核巨噬細(xì)胞的雙重作用[2]。MCP-l是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，通過誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的進(jìn)展。MCP-1參與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病炎癥反應(yīng)過程[3]。深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis, DVT）是一種血液在深靜脈內(nèi)異常凝結(jié)導(dǎo)致的靜脈回流障礙性疾病，DVT的病理生理過程包括血管壁損傷、血流淤滯、血液高凝狀態(tài)、炎癥反應(yīng)等，其中炎癥反應(yīng)對(duì)DVT的發(fā)生發(fā)展起到重要作用[4]。目前已有研究表明，在DVT形成過程中，MCP-1協(xié)同白細(xì)胞介素（IL）-6等炎性因子也發(fā)揮重要作用[5]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)MCP-1在細(xì)胞層面進(jìn)行研究，通過生物信息學(xué)分析，探索其相關(guān)信號(hào)通路的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 過表達(dá)慢病毒載體及shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體購于Ambion公司；轉(zhuǎn)染試劑購于QIAGEN公司；TRIzol、熒光定量引物、二抗IgG-HRP購于Invitrogen公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于Fermentas公司；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)購于OMEGA公司；PVDF膜購于Millipore公司；一抗購于Santan和康為公司；Real-time PCR用96孔板及膜、ECL顯色試劑盒購于Bio-Rad公司；離心管、槍尖、PCR管購于Axygen公司；X線片購于柯達(dá)公司；HUVECs細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)耗材購于Corning公司。

1.2 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，免疫熒光及免疫共沉淀檢測(cè) 原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，制作細(xì)胞爬片，分別以抗人MCP-1抗體孵育，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗與之結(jié)合，激光共聚焦拍照觀察蛋白在細(xì)胞中的定位，設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞，收集、裂解細(xì)胞，以抗人MCP-1抗體進(jìn)行IP反應(yīng)，在反應(yīng)中加入Protein A+G Agarose吸附MCP-1抗體，離心收集磁珠/抗體/蛋白復(fù)合物，將復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE分析，以銀染顯色，分離的條帶挖膠進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3 人MCP-1基因慢病毒過表達(dá)載體構(gòu)建 通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索人MCP-1基因完整CDS序列，用BLAST分析尋找特異性設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)軟件為primer 5.0，上游5′-GCAAGCTTATGCCTTGTGTTCAGGCG-3′，下游5′-GCCTCGAGTTAGAAAGGTAAGGTGTC-3′，產(chǎn)物長度300 bp。行PCR反應(yīng)，條件如下：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30次循環(huán)，72℃延伸10 min。對(duì)人MCP-1基因進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度為58℃，通過進(jìn)行膠回收行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；將收集膠回收的目的片段和質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，以pCDH-GFP為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。

1.4 人MCP-1基因逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾載體構(gòu)建 人MCP-1基因逆轉(zhuǎn)錄病毒Oligo片段擴(kuò)增，利用Oligoengine在線軟件設(shè)計(jì)2條22個(gè)堿基的候選siRNA靶序列。miR30FWD(Xho Ⅰ)：5′-CAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGT-3′，miR30REV(EcoRⅠ)：5′-CTAAAGTAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCA-3′，篩選出G+C含量小于50％，且與哺乳動(dòng)物的其他基因沒有同源性的最優(yōu)siRNA靶序列，再根據(jù)MSCV-LMP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出相應(yīng)的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的shRNA模板。將合成的Oligo片段稀釋后，退火溫度52℃，條件如下：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30次循環(huán)，72℃延伸10 min。進(jìn)行PCR反應(yīng)。干擾片段擴(kuò)增后，行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。把膠回收的目的片段和質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，以LMP為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。

1.5 過表達(dá)/干擾載體病毒包裝、感染 病毒宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞，HUVECs為感染細(xì)胞。pCDH-GFP(12 μg)的包裝質(zhì)粒為pCL-ECO，用量8 μg；轉(zhuǎn)染人MCP-1-pCDH-GFP過表達(dá)質(zhì)粒，MSCV-LMP(12.5 μg)包裝質(zhì)粒分別是：pAPAX(7.5 μg)、pMD2.G(5 μg)；分別轉(zhuǎn)染人MCP-1-LMP shRNAmir1、2質(zhì)粒，總時(shí)間感染48～72 h后，為檢測(cè)所構(gòu)建干擾載體是否能有效上調(diào)和下調(diào)目的基因表達(dá)，將構(gòu)建質(zhì)粒分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞。檢測(cè)MCP-1 mRNA實(shí)驗(yàn)部分分為過表達(dá)實(shí)驗(yàn)及干擾實(shí)驗(yàn)，在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置：正常組（正常細(xì)胞）、空白組（轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞）、過表達(dá)組；在干擾實(shí)驗(yàn)中設(shè)置：正常組（正常細(xì)胞）、空白組（轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞）、干擾1組、干擾2組。檢測(cè)MCP-1蛋白水平實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置：正常組（正常細(xì)胞）、過表達(dá)組、干擾1組、干擾2組。

1.6 Real-time PCR測(cè)定人MCP-1 mRNA水平 TRIzol抽提細(xì)胞總RNA；依據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行cDNA合成。SYBR熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)軟件為primer 5.0，人MCP-1上游引物5′-CAAGCAGAAGTGGGTTCAGGATT-3′，下游引物5′-TCTTGGGTTGTGGAGTGAGTGTTC-3′，產(chǎn)物長度89 bp。βactin上游引物5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-GACGCCAGTAGACTCCACGACA-3′，產(chǎn)物長度180 bp。Real-time反應(yīng)兩步法條件如下：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火/延伸60 s，共40次循環(huán)。實(shí)驗(yàn)依據(jù)Maxima?SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×)（Fermentas）操作。結(jié)果的參數(shù)主要是觀察熔解曲線和擴(kuò)增曲線，用軟件DataAssist?v3.0 Software（ABI）以2-ΔΔCt方法來對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照組。

1.7 人MCP-1蛋白水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞總蛋白提?。菏占鹘MHUVECs后添加Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF) （Sigma）的RIPA裂解液（Beyotime），冰浴30 min；4℃12 000 r/min離心5 min；取上清，再用BCA法測(cè)定計(jì)算蛋白濃度。蛋白免疫印跡法（Western Blot）分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況：將電泳分離后的細(xì)胞總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物PVDF膜上，然后以特異性抗體(一抗MCP-1/β-actin，兔抗人，1∶1 000)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，Bio-Rad膜成像系統(tǒng)下顯色成像并用Quantity One軟件對(duì)比分析。

1.8 人MCP-1細(xì)胞系過表達(dá)/沉默后轉(zhuǎn)錄譜變化 按前文轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將收獲轉(zhuǎn)染了人的MCP-1-LMP shRNAmir1、MCP-1-pCDH-GFP過表達(dá)的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞作為對(duì)照，提取總RNA，分組為（1）正常組細(xì)胞。（2）MCP-1-pCDH-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞。（3）MCP-1-LMP shRNAmir1轉(zhuǎn)染細(xì)胞。進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片分析，每樣品1張芯片，共3個(gè)基因芯片；樣本送至上?？党缮锕こ逃邢薰具M(jìn)行基因芯片檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；比較組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用Tukey及Scheffe法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人MCP-1基因慢病毒過表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾載體構(gòu)建 慢病毒過表達(dá)載體構(gòu)建，PCR擴(kuò)增人MCP-1目的基因，瓊脂糖電泳清晰可見單一的目的條帶；本研究選取慢病毒載體pCDH-GFP中，EcoRⅠ和BamHⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)來連接載體與目的基因，見圖1。依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LMP質(zhì)粒載體特點(diǎn)，固定選取XhoⅠ和EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)來進(jìn)行連接，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾載體。擴(kuò)增人MCP-1-LMP shRNAmir1、2干擾載體，條帶在 985 bp/ 7 019 bp表明已插入目的條帶，屬于陽性克隆。每個(gè)載體挑取2個(gè)克隆，進(jìn)行初步的酶切鑒定，見圖2。

Fig.1 Electrophoresis result of human MCP-1 PCR products and pCDH-GFP plasmid profile圖1 人MCP-1PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)及pCDH-GFP質(zhì)粒圖譜

Fig.2 H MCP-1 carrier enzyme identification and LMP lentiviral vector圖2 載體酶切鑒定圖譜及慢病毒載體LMP質(zhì)粒圖譜

2.2 過表達(dá)及抑制效率檢測(cè) 檢測(cè)MCP-1 mRNA過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)組（5.365±0.752）較正常組（1.007±0.276）及空白組（1.223±0.426）mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（F=65.895，P＜0.05），正常組及空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。檢測(cè)MCP-1 mRNA干擾實(shí)驗(yàn)中，干擾1組mRNA表達(dá)（0.052±0.019）較正常組（1.004±0.161）、空白組（0.998±0.206）及干擾2組（0.968±0.306）表達(dá)明顯下調(diào)（F=16.169，P＜0.05）。檢測(cè)MCP-1蛋白水平實(shí)驗(yàn)中，正常組、過表達(dá)組及干擾1、2組Ratio值分別為：0.62、0.84、0.24、0.56，過表達(dá)組蛋白水平較正常組明顯上調(diào)，干擾1組較正常組及干擾2組明顯下調(diào)，見圖3。

Fig.3 Results of Western blot analysis for protein expressions of human MCP-1圖3 Western blot檢測(cè)人MCP-1蛋白表達(dá)水平結(jié)果

2.3 人MCP-1細(xì)胞系過表達(dá)/沉默后轉(zhuǎn)錄譜的變化 MCP-1-pCDH-GFP過表達(dá)載體、MCP-1-LMP shRNAmir1干擾載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，收獲正常組細(xì)胞（轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞）；MCP-1-pCDH-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞；MCP-1-LMP shRNAmir1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，行基因芯片檢測(cè)，基因芯片檢測(cè)到的所有表達(dá)變化的基因熱譜圖，其中紅色表示相對(duì)高表達(dá)，綠色代表相對(duì)低表達(dá)，見圖4?；蛐酒瑱z測(cè)結(jié)果根據(jù)KEGG Pathway分析可見，與正常細(xì)胞相比，過表達(dá)載體MCP-1-pCDH-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞有18條信號(hào)通路下調(diào)，7條信號(hào)通路上調(diào)；干擾載體MCP-1-LMP shRNAmir1轉(zhuǎn)染細(xì)胞有60條信號(hào)通路下調(diào)，15條信號(hào)通路上調(diào)，見圖5～8。

Fig.4 Gene chip thermography圖4 基因芯片熱譜圖

Fig.5 Compared with normal group,MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells showed 18 down-expressed signaling pathways圖5 與正常細(xì)胞相比MCP-1-pCDH-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞18條信號(hào)通路下調(diào)

Fig.6 Compared with normal group,MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells showed 7 up-expressed signaling pathways圖6 與正常細(xì)胞相比MCP-1-pCDH-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞7條信號(hào)通路上調(diào)

Fig.7 Compared with normal group,MCP-1-LMP shRNAmir1-transfected cells showed 60 down-expressed signaling pathways圖7 與正常細(xì)胞相比MCP-1-LMP shRNAmir1轉(zhuǎn)染細(xì)胞60條信號(hào)通路下調(diào)

Fig.8 Compared with normal group,MCP-1-LMP shRNAmir1-transfected cells showed 15 up-expressed signaling pathways圖8 與正常細(xì)胞相比MCP-1-LMP shRNAmir1轉(zhuǎn)染細(xì)胞15條信號(hào)通路上調(diào)

3 討論

靜脈血栓栓塞(VTE)是一種多原因引起的，多基因相關(guān)的疾病，包括DVT和肺動(dòng)脈栓塞(PE)。在西方國家DVT和PE的發(fā)病率分別約為0.93％和0.05％，外科手術(shù)后行抗凝治療的患者，DVT的發(fā)生率為9.6％[6]。19世紀(jì)，Virchow提出靜脈血栓形成的三聯(lián)病因：靜脈壁損傷、血流滯緩和血液高凝狀態(tài)的致栓學(xué)說，但內(nèi)涵已從早期的病理解剖深化到現(xiàn)代的分子水平機(jī)制研究[7]。根據(jù)現(xiàn)階段對(duì)DVT形成機(jī)制的研究，參與DVT形成的關(guān)鍵角色有：血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、膠原、炎性因子、血流動(dòng)力學(xué)等，各因素間彼此相互影響，導(dǎo)致靜脈內(nèi)環(huán)境中凝血/抗凝、纖溶/抗纖溶系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡打破，最終導(dǎo)致血栓形成[8]。但現(xiàn)階段只了解DVT部分形成機(jī)制，近年來隨著對(duì)血栓疾病不斷深入研究，尚有很多未被發(fā)現(xiàn)的因素直接或間接地影響血栓形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，調(diào)控血栓形成。而針對(duì)DVT形成的分子機(jī)制，已發(fā)現(xiàn)有大量的基因、蛋白在血栓形成過程中起到重要作用，并且部分在動(dòng)脈血栓等心血管疾病中得到證實(shí)[9-10]。

趨化因子的重要成員MCP-1是一種堿性蛋白，為76個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白單鏈。MCP-1的受體 CC趨化因子受體 2(CC chemokine receptor 2，CCR2)是一類含有7個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體，位于3號(hào)染色體上，在各種細(xì)胞類型上都有發(fā)現(xiàn)，包括嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞。MCP-1與CCR2結(jié)合后，受體變構(gòu)并與G蛋白結(jié)合，激活磷酸肌醇等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)作用[11]。目前在心血管疾病中MCP-1的研究較廣泛。Park等[12]也發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死的早期階段，形成良好側(cè)支循環(huán)的患者比沒有形成側(cè)支循環(huán)的患者血漿中MCP-I的水平明顯增加，表明MCP-l的過度表達(dá)在急性心肌梗死的早期階段對(duì)側(cè)支循環(huán)的形成有重要意義，可能為早期急性心肌梗死的治療提供新的途徑。宋軍鋒等[13]研究發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征患者的MCP-1水平較穩(wěn)定型心絞痛和正常對(duì)照組患者增高，證實(shí)MCP-l是動(dòng)脈粥樣硬化和斑塊不穩(wěn)定的指標(biāo)，且MCP-l水平與冠脈側(cè)支形成呈正相關(guān)。許政等[14]構(gòu)建兔右頸總動(dòng)脈瘤模型，研究發(fā)現(xiàn)在模型腦動(dòng)脈瘤壁中有大量的MCP-1的表達(dá)，表達(dá)細(xì)胞主要為平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，提示動(dòng)脈瘤壁的組成細(xì)胞能不斷產(chǎn)生趨化因子，趨化單核細(xì)胞，加強(qiáng)炎性反應(yīng)。提示了在腦動(dòng)脈瘤發(fā)病過程中，MCP-1基因作為早期表達(dá)基因，其表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)了單核巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈壁的黏附，進(jìn)一步使動(dòng)脈壁彈力纖維降解，促進(jìn)了腦動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。現(xiàn)已證明，動(dòng)脈粥樣硬化(Atheroselerosis，As)是一種慢性炎癥性疾病，細(xì)胞因子在As的各個(gè)階段中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，MCP-l是與As具有密切關(guān)系的細(xì)胞因子之一[14]。Kawanami等[15]發(fā)現(xiàn)Rho-kinase可激活凝血酶，通過p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路，使MCP-l表達(dá)上調(diào)。Lin等[16]發(fā)現(xiàn)MCP-l對(duì)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附方面起到重要作用。但目前MCP-l在DVT形成過程中的具體機(jī)制尚未闡明。

本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建人MCP-1過表達(dá)/干擾載體MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP shRNAmir1經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后感染HUVECs，應(yīng)用基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比，過表達(dá)載體MCP-1-pCDH-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞有18條信號(hào)通路下調(diào)，7條信號(hào)通路上調(diào)；干擾載體MCP-1-LMP shRNAmir1轉(zhuǎn)染細(xì)胞有60條信號(hào)通路下調(diào)，15條信號(hào)通路上調(diào)。

隨著對(duì)MCP-1的生物學(xué)功能、基因定位和調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，以及它對(duì)其他細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞的調(diào)控的深入研究，探索如何對(duì)其中的某些環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，將為DVT分子機(jī)制的研究提供新思路。

[1] Hashizume M,Mihara M.Blockade of IL-6 and TNF-a inhibited oxLDL-induced production of MCP-1 via scavenger receptor induction[J].Eur J Pharmacol,2012,689(1-3):249-254.doi:10.1016/j. ejphar.2012.05.035.

[2] Koo TY,Kim YJ,Yang WS,et al.Mycophenolic acid regulates spleen tyrosine kinase to repress tumour necrosis factor-alpha-induced monocyte chemotatic protein-1 production in cultured human aortic endothelial cells[J].Cell Biol Int,2013,37(1):19-28.doi: 10.1002/cbin.10003.

[3]Younce CW,Kolattukudy PE.MCP-1 causes cardiomyoblast death via autophagy resulting from ER stress caused by oxidative stress generated by inducing a novel zincnger protein,MCPIP[J].Biochem J,2010,426(1):43-53.doi:10.1042/BJ20090976.

[4]Bouman AC,Smits JJ,Ten Cate H,et al.Markers of coagulation,fibrinolysis and inflammation in relation to post-thrombotic syndrome [J].J Thromb Haemost，2012,10:1532-1538.doi:10.1111/j.1538-7836.2012.04798.x.

[5] Hassanian SM,Dinarvnd P.Adenosine regulates the proinflammatory signaling function of thrombin in endothelial cells[J].Cell Physiol,2014,229:1292-1300.doi:10.1002/jcp.24568.

[6] Pabinger-Fasching I,Eichinger-Hasenauer S,Grohs J,et al.Prevention of venous thromboembolism in musculoskeletal surgery[J]. Wien Klin Wochenschr,2014,126(9-10):298-310.doi:10.1007/ s00508-014-0509-5.

[7]Huisman MV,Klok FA.Diagnostic management of acute deep vein thrombosis and pulmonary embolism[J].J Thromb Haemost,2013,11 (3):412-422.doi:10.1111/jth.12124.

[8]Keeling D,Alikhan R.Management of venous thromboembolism–controversies and the future[J].Br J Haematol,2013,161(6):755-763.doi:10.1111/bjh.12306.

[9]Rodriguez AL,Wojcik BM,Wrobleski SK,et al.Statins,inflammation and deep vein thrombosis:a systematic review[J].J Thromb Thrombolysis,2012,33(4):371-382.doi:10.1007/s11239-012-0687-9.

[10]Bouman AC,Cheung YW,Spronk HM,et al.Biomarkers for post thrombotic syndrome:A case-control study[J].Thromb Res,2014, 134(2):369-375.doi:10.1016/j.thromres.2014.06.010.

[11]Matos MF,Louren?o DM,Orikaza CM,et al.The role of IL-6,IL-8 and MCP-1 and their promoter polymorphisms IL-6-174GC,IL-8-251AT and MCP-1-2518AG in the risk of venous thromboembolism:A case-control study[J].Thromb Res,2011,128(3):216-220.doi:10.1016/j.thromres.2011.04.016.

[12]Park HJ,Chang K,Park CS,et al.Coronary collaterals:The role of MCP-I during the early phase of acute myocardial infraction[J].Int Cardiol,2008,130(3):409-413.doi:10.1016/j.ijcard.2007.08.128.

[13]Song JF,Cheng XP,Li RQ,et al.Correlation study on serum monocyte chemoattractant protein-I levels and coronary collateral circulation in patients with acute coronary syndrome[J].National Medical Frontiers of China,2011,6(21)：1-2.[宋軍鋒,陳小平,李潤琴,等. MCP-1與急性冠脈綜合征患者冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)療前沿,2011,6（21）：1-2.]doi:10.3969/j.issn.1673-5552.2011.21.0001.

[14]Xu Z,Zhang SM,Jiao L,et al.The effects of the expression of NF-κB,MCP-1 and MMP-9 on experimental cerebral aneurysm rabbit model[J].Chin J Neurosurg,2011,27(6):630-634.[許政,張世明,焦磊，等.NF-κB激活及MCP-1和MMP-9表達(dá)在兔頸總動(dòng)脈瘤中的作用[J].中華神經(jīng)外科雜志,2011,27(6):630-634.]doi: 10.3760/cma.j.issn.1001-2346.2011.06.031.

[15]Kawanami D,Matoba K,Kanazawa Y,et al.Thrombin induces MCP-1 expression through Rho-kinase and subsequent p38MAPK/ NF-kB signaling pathway activation in vascular endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2011,411(12):798-803.doi: 10.1016/j.bbrc.2011.07.031.

[16]Lin Y,Zhen Y,Liu J,et al.Rhein lysinate inhibits monocyte adhesion to human umbilical vein endothelial cells by blocking p38 signaling pathway[J].Arch Pharm Res，2013,36(11):1410-1418.doi: 10.1007/s12272-013-0156-9.

（2014-05-26收稿 2014-08-07修回）

（本文編輯 魏杰）

The Study of Signaling Pathways in MCP-1 Over-Expression/Interference of HUVECs

SONG En,LI Guangdi,ZHOU Rudan,ZHAO Xueling△
Orthopedics Department of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China△

E-mail:zxldoctor@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the association between the signaling pathways of MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells and deep venous thrombosis(DVT).MethodsThe cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were tested by immunofluorescence and co-immunoprecipitation methods.The constructed MCP-1 over-expression/interference vector,and the change of transcription profile were detected by microarray assay and biological information technology analysis.ResultsMCP-1 over-expression/interference vector MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP shRNAmir1 was constructed and HUVECs were transfected.According to the microarray analysis we found that there were 18 down-expressed signaling pathways and 7 up-expressed signaling pathways in MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells.There were 60 downexpressed signaling pathways and 15 up-expressed signaling pathways in the MCP-1-LMP shRNAmir1 transfected cells.ConclusionSignaling pathways of MCP-1 plays an important role in DVT formation，which may provide us a new way to study molecular mechanism of DVT.

monocytes;chemotactic factors;endothelium,vascular;umbilical veins;signal transduction;venous thrombosis;monocyte chemoattractant protein-1;human umbilical vein endothelial cells

R543

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（801060151）；云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012ws0007）；云南省科技廳重點(diǎn)新產(chǎn)品開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2010BC010）

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科（郵編650032）

△通訊作者 E-mail:zxldoctor@hotmail.com