荊雪寧邱 波戰(zhàn)文翔武繼彪

黃芪多糖誘導的樹突狀細胞疫苗對S180荷瘤小鼠Th1/Th2類細胞因子的影響

荊雪寧1邱 波2戰(zhàn)文翔1武繼彪1

目的 探討黃芪多糖誘導成熟的樹突狀細胞（DC）腫瘤疫苗對S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及作用機制。方法體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的DC，加入黃芪多糖誘導成熟，以S180腫瘤抗原致敏獲得DC腫瘤疫苗。建立S180荷瘤小鼠模型，分為模型組、環(huán)磷酰胺組、黃芪多糖組、細胞因子組，在荷瘤第5天和第10天分別給予相應治療。荷瘤第12天摘取腫瘤組織、胸腺、脾臟稱質量，計算抑瘤率、胸腺指數、脾臟指數；ELISA法檢測小鼠血清白細胞介素（IL）-4、干擾素（IFN）-γ水平。結果黃芪多糖組、細胞因子組的抑瘤率高于環(huán)磷酰胺組（64.25％、64.10％vs 35.11％），胸腺指數高于環(huán)磷酰胺組（1.69±0.26、1.74±0.38 vs 1.45±0.22），脾臟指數高于環(huán)磷酰胺組(5.44±0.76、5.31± 0.81 vs 3.54±0.52)，IL-4水平(ng/L)低于環(huán)磷酰胺組（15.66±2.57、14.72±4.84 vs 23.95±6.07），IFN-γ水平(ng/L)高于環(huán)磷酰胺組（16.54±3.71、17.20±2.03 vs 10.37±2.19），差異均有統計學意義。結論黃芪多糖誘導的DC疫苗可有效發(fā)揮抑瘤作用，其機制可能與提高荷瘤小鼠胸腺指數與脾臟指數，調節(jié)細胞因子表達，促進Th1/Th2失衡向Th1細胞占優(yōu)勢的細胞免疫偏移，增強機體的抗腫瘤免疫功能有關。

黃芪多糖；樹突細胞；白細胞介素4；干擾素Ⅱ型；抑瘤率；胸腺指數；脾臟指數；Th1/Th2

黃芪多糖是中藥黃芪的主要活性成分之一，具有顯著的免疫調節(jié)和抗腫瘤作用。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是機體功能最強大的抗原遞呈細胞，捕獲抗原后可有效遞呈可溶性腫瘤抗原，激活靜息T細胞，在特異性抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用?；贒C具有誘導初始免疫應答、增強機體特異性抗腫瘤免疫反應的能力，選擇DC作為載體制備腫瘤疫苗被認為是最具潛力的腫瘤免疫治療手段[1]。黃芪多糖的抗腫瘤和免疫調節(jié)作用已在體內外實驗中得到證實[2]，但是關于黃芪多糖對DC影響的研究較少。本研究以黃芪多糖代替腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）誘導小鼠來源的DC成熟，以S180腫瘤抗原致敏，制備DC腫瘤疫苗，通過對S180荷瘤小鼠進行免疫治療，探討黃芪多糖誘導成熟的DC腫瘤疫苗的體內抑瘤效果及機制，為開拓中藥治療腫瘤的途徑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和瘤株 雄性昆明種小鼠，6～8周齡，體質量18～20 g。購于山東大學實驗動物中心，動物許可證號為SCXK（魯）20090001。小鼠肛門肉瘤細胞S180購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要藥品和試劑 黃芪多糖，純度＞98％，天津賽諾制藥有限公司生產。環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥公司產品。RPMI1640，Gibco公司生產；胎牛血清，Hyclone公司生產；小鼠淋巴細胞分離液購自北京索寶來科技有限公司，Hanks液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組白細胞介素-4（rmIL-4）、重組TNF-α（rmTNF-α）購自PeproTech公司，小鼠IL-4、干擾素（IFN）-γ ELISA試劑盒購自RayBiotech公司。FITC標記大鼠抗小鼠CD80、PE標記大鼠抗小鼠CD86抗體購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DC腫瘤疫苗的制備 （1）小鼠骨髓單個核細胞的獲取。昆明種小鼠用頸椎脫位法處死，浸入75％乙醇浸泡10 min。無菌環(huán)境取雙側股骨、脛骨，剝離附著的肌肉軟組織，用無血清RPMI1640沖洗，剪開骨兩端，用1 mL注射器抽取無血清RPMI1640，插入骨髓腔反復沖洗至紅色變淺。將收集的骨髓沖洗液以1 500 r/min離心10 min。以RPMI1640培養(yǎng)液重懸骨髓細胞，用淋巴細胞分離液密度梯度離心法獲得小鼠骨髓來源的單個核細胞。（2）DC的體外誘導與鑒定。用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將細胞濃度調至2×106/mL，加入細胞培養(yǎng)瓶，每孔6 mL，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后吸出懸浮細胞，留取貼壁細胞即為單核細胞。向培養(yǎng)瓶加入含rmGM-CSF 100 μg/L、rmIL-4 100 μg/L、10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液6 mL，繼續(xù)培養(yǎng)。第2天、第4天行半量換液，第5天分別加入黃芪多糖100 mg/L和rm TNF-α 20 μg/L誘導成熟。第7天收集2種方法誘導的DC細胞，調細胞濃度為1×106/mL，向細胞中加入FITC標記的CD80和PE標記的CD86抗體，終濃度為5 mg/L。4℃避光保存30 min。用PBS洗滌2次，用流式細胞儀進行檢測。（3）負載S180腫瘤全抗原的DC疫苗的制備。離心收集S180腹水瘤小鼠腹水中的S180細胞，調整細胞濃度為1× 108/mL，液氮反復凍融4次，制備成腫瘤完全抗原。各組DC培養(yǎng)的第8天，向培養(yǎng)體系加入S180腫瘤抗原0.2 mL，DC與腫瘤抗原的比例為1∶20(抗原的量按凍融前腫瘤細胞的量計)。第9天，收集細胞，獲得負載腫瘤抗原的DC疫苗，調細胞數為1×106/mL。

1.2.2 S180荷瘤小鼠模型的建立及動物分組 將小鼠肛門肉瘤S180細胞接種于小鼠腹腔，待腹部膨出時，抽取腹水，以生理鹽水稀釋，進行細胞計數，調整細胞濃度為1×107/mL，于小鼠右腋筋膜下接種0.2 mL，每次接種40只。將荷瘤第5天的小鼠隨機分為模型組、環(huán)磷酰胺組、黃芪多糖組、細胞因子組，每組10只。

1.2.3 荷瘤小鼠免疫治療 模型組腹腔注射生理鹽水0.2 mL，其余3組分別經荷瘤部位和腹腔注射，環(huán)磷酰胺組注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，黃芪多糖組注射經黃芪多糖誘導的DC疫苗0.2 mL，細胞因子組注射經TNF-α誘導的DC疫苗0.2 mL。5 d后再注射1次。

1.2.4 檢測指標 （1）胸腺指數、脾臟指數、抑瘤率。荷瘤第12天，頸椎脫位法處死小鼠。剝離小鼠胸腺、脾臟及腫瘤組織，用濾紙吸干并稱質量，分別計算胸腺指數、脾臟指數及抑瘤率。胸腺指數=胸腺質量（mg）/體質量（g），脾臟指數=脾臟質量（mg）/體質量（g），抑瘤率（％）=（模型組平均瘤質量－實驗組平均瘤質量）/模型組平均瘤質量×100％。（2）IL-4、IFN-γ的檢測。荷瘤第12天，各組小鼠經眼球摘除法采血，4℃靜置過夜，次日3 000 r/min離心10 min，收集血清，用ELISA法檢測小鼠血清IL-4、IFN-γ水平，嚴格按照ELISA試劑盒操作說明進行。

2 結果

2.1 DC的形態(tài)與表型鑒定 單個核細胞形態(tài)規(guī)則呈球形，透光度好，細胞膜表面光滑。加入細胞因子后第3天，細胞呈半貼壁，部分細胞懸浮，體積增大，形狀不規(guī)則似星形、梭形，有少量突起。第5天，細胞變圓，有大量突起，可見不太規(guī)則的樹突狀外形。第7天，懸浮細胞增多，胞漿透明，胞體增大，有毛刺樣突起，呈典型的DC形態(tài)。見圖1。DC培養(yǎng)第7天，黃芪多糖組細胞表面CD80陽性、CD86陽性及CD80和CD86雙陽性的表達率顯著高于細胞因子組（P＜0.05），見表1。

Fig.1 The morphology of DC induced by cytokines and astragalus polysaccharide（×200）圖1 細胞因子和黃芪多糖誘導的DC形態(tài)（×200）

Tab.1 Expressions of CD80 and CD86 on DC induced by cytokines and astragalus polysaccharide表1 細胞因子和黃芪多糖誘導的DC表面CD80、CD86表達情況 （n=10，％，±s）

Tab.1 Expressions of CD80 and CD86 on DC induced by cytokines and astragalus polysaccharide表1 細胞因子和黃芪多糖誘導的DC表面CD80、CD86表達情況 （n=10，％，±s）

＊P＜0.05

?

2.2 黃芪多糖誘導的DC疫苗對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 環(huán)磷酰胺組、細胞因子組、黃芪多糖組的瘤體質量低于模型組，抑瘤率分別為35.11％、64.10％、64.25％，黃芪多糖組瘤體質量低于環(huán)磷酰胺組（P＜0.05），而與細胞因子組無明顯差異(P＞0.05)，見表2。

2.3 黃芪多糖誘導的DC疫苗對S180荷瘤小鼠免疫器官指數的影響 與環(huán)磷酰胺組相比，黃芪多糖組、細胞因子組小鼠的胸腺指數、脾臟指數均顯著提高（P＜0.05），而黃芪多糖組與細胞因子組之間無明顯差異(P＞0.05)，見表2。

Tab.2 Comparison of tumor weight and immune organ index between four groups of mice表2 各組荷瘤小鼠的瘤體質量與免疫器官指數（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of tumor weight and immune organ index between four groups of mice表2 各組荷瘤小鼠的瘤體質量與免疫器官指數（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與模型組比較，b與環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05

組別模型組環(huán)磷酰胺組細胞因子組黃芪多糖組F或χ2瘤體質量（g）2.011±0.032 1.305±0.018a0.722±0.015ab0.719±0.023ab33.052＊＊胸腺指數（mg/g）2.11±0.15 1.45±0.22a1.74±0.38ab1.69±0.26ab7.831＊脾臟指數（mg/g）4.77±0.36 3.54±0.52a5.31±0.81ab5.44±0.76ab11.324＊

2.4 黃芪多糖誘導的DC疫苗對S180荷瘤小鼠血清IL-4、IFN-γ水平的影響 與模型組比較，黃芪多糖組、細胞因子組小鼠血清IL-4水平顯著下降，IFN-γ水平明顯增加（P＜0.05）。黃芪多糖組與細胞因子組相比，IL-4、IFN-γ水平差異無統計學意義,見表3。

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-4 and IFN-γ between four groups of mice表3 各組小鼠血清IL-4、IFN-γ水平比較（n=10，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-4 and IFN-γ between four groups of mice表3 各組小鼠血清IL-4、IFN-γ水平比較（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與模型組比較，b與環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05

組別模型組環(huán)磷酰胺組細胞因子組黃芪多糖組F IL-4 19.08±3.11 23.95±6.07a14.72±4.84a15.66±2.57a10.253＊＊IFN-γ 11.23±0.77 10.37±2.19 17.20±2.03ab16.54±3.71ab17.560＊＊

3 討論

黃芪多糖對肝癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，可以增強實驗動物的免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤的作用。很多研究結果提示黃芪多糖可通過抑制腫瘤細胞生長[3]、促進抗腫瘤細胞因子分泌[4]、誘導細胞周期停滯[5]、降低端粒酶活性[6]等機制發(fā)揮抗腫瘤作用。鄧旻等[7]研究發(fā)現黃芪多糖體可在體外誘導臍血單核細胞定向分化為成熟的DC，但關于黃芪多糖誘導的DC體內抗腫瘤作用的研究較少。

本研究發(fā)現黃芪多糖誘導小鼠骨髓來源的未成熟DC呈典型的DC形態(tài)，其表面協同刺激分子CD80、CD86的表達顯著高于細胞因子誘導的成熟DC，提示黃芪多糖可以有效誘導DC表達協同刺激分子，利于DC提呈抗原。用S180腫瘤全抗原致敏的DC腫瘤疫苗對S180荷瘤小鼠進行免疫治療，結果顯示黃芪多糖組、細胞因子組小鼠的瘤體質量低于模型組和環(huán)磷酰胺組，而胸腺指數、脾臟指數顯著高于陽性對照環(huán)磷酰胺組，與細胞因子組相比，黃芪多糖組的各項指標均無明顯差異，提示黃芪多糖誘導的DC腫瘤疫苗在抗腫瘤的同時，能改善荷瘤小鼠的免疫功能。

Th1介導的細胞免疫在機體抗腫瘤免疫中占有重要地位。正常情況下，Th1和Th2處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，并相互制約，以維持機體正常的免疫功能[8]。很多腫瘤患者體內發(fā)生Th1細胞受到抑制而Th2細胞占優(yōu)勢的現象，即Th1/Th2漂移，機體的抗腫瘤免疫受到嚴重抑制[9]。目前尚無區(qū)分Th1和Th2細胞的表面標志物，通常以IFN-γ評判Th1細胞功能，IL-4評判Th2細胞功能。本研究顯示，黃芪多糖組、細胞因子組小鼠血清IFN-γ水平顯著升高，IL-4水平顯著下降，提示黃芪多糖誘導的DC疫苗能糾正荷瘤小鼠的Th1/Th2失衡，改善免疫狀態(tài)，增強抗腫瘤的免疫功能。

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(2014-05-10收稿 2014-06-30修回)

（本文編輯 閆娟）

The Inhibitory Effect of Dendritic Cell Tumor Vaccine Induced by Astragalus Polysaccharides on the Expression of Cytokines Th1/Th2 in S180 Tumor-Bearing Mice

JING Xuening1,QIU Bo2,ZHAN Wenxiang1,WU Jibiao1
1 Shandong College of Traditional Chinese Medicine,Yantai 264199，China;2 Yantai Central Hospital of Laiyang City

ObjectiveTo study the antitumor effects of dendritic cell vaccine induced by astragalus polysaccharides on S180 tumor-bearing mice,and its possible mechanism.MethodsDendritic cells derived from mouse bone marrow were induced maturation by astragalus polysaccharides and loaded with S180 tumor antigen to prepare tumor vaccine.Tumor-bearing mice were divided into four groups and treated on day-5 and day-10 respectively.Group A was injected with NS,Group B with CTX(50 mg/kg),Group C with dendritic cells induced by astragalus polysaccharides and Group D with dendritic cells induced by tumor necrosis factor(TNF)-α.After 12 days of tumor-bearing,the animals were killed.The subcutaneous sarcoma,thymus and spleen were separated and weighted.The inhibitory rate,thymus index and spleen index were then calculated.ELISA assay was used to detect the levels of interleukin(IL)-4,interferon(IFN)-γ in serum of tumor bearing mice.ResultsThe tumor inhibition rate was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(64.25％,64.10％vs 35.11％).The thymus index was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(1.69±0.26,1.74±0.38 vs 1.45±0.22).The spleen index was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(5.44±0.76,5.31±0.81 vs 3.54±0.52).The level of IL-4 was lower in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(15.66±2.57,14.72±4.84 vs 23.95± 6.07).The level of IFN-γ was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(16.54± 3.71,17.20±2.03 vs 10.37±2.19).All the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionDendritic cell vaccine induced by astragalus polysaccharides can effectively inhibit tumor growth.Its mechanism may be associated with the promotion spleen index and thymus index of S180 tumor-bearing mice,the effective correction of Th1/Th2 imbalance induced by tumor,and the enhancement of antitumor immune responses.

astragalan；dendritic cells；interleukin-4；interferon typeⅡ；tumor inhibition rate；thymus index；spleen index；Th1/Th2

R730.3

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.007

山東省中醫(yī)藥科學技術研究項目（2009-254）

1山東煙臺，山東中醫(yī)藥高等?？茖W校（郵編264199）;2煙臺市萊陽中心醫(yī)院