趙蘊珍 李佳怡

多西環(huán)素對乳腺癌小鼠移植瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響

趙蘊珍 李佳怡

目的通過檢測多西環(huán)素對小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型（BCML-TAⅡ99）中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)蛋白表達水平，揭示其對該腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響。方法建立BCML-TAⅡ99模型，應用免疫組織化學SP法檢測MMP-9和TIMP-1蛋白在多西環(huán)素給藥組與對照組腫瘤組織中的表達情況，并進行比較。結(jié)果與對照組相比，給藥組腫瘤轉(zhuǎn)移率明顯低于對照組；MMP-9蛋白在給藥組表達下調(diào)，而TIMP-1蛋白表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且MMP-9與TIMP-1表達呈負相關（P＜0.05）。結(jié)論多西環(huán)素可通過調(diào)節(jié)MMP-9及TIMP-1蛋白表達水平，對BCML-TAⅡ99模型中腫瘤生長及轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用。

多西環(huán)素；乳腺腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；肺；基質(zhì)金屬蛋白酶9；金屬蛋白酶類組織抑制劑；小鼠,近交系;乳腺癌

乳腺癌因較高的發(fā)病率和病死率已成為嚴重危及人類生命的惡性腫瘤之一。影響乳腺癌預后的因素很多，而癌細胞是否發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移是判定患者預后的重要臨床指標。細胞外基質(zhì)（ECM）的降解與乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關，在其降解過程中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的作用尤為重要。作為MMPs的廣譜抑制劑，多西環(huán)素的抗腫瘤作用越來越被關注[1]。本研究采用小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型（BCMLTAⅡ99）進行多西環(huán)素給藥實驗，通過檢測腫瘤組織MMP-9和金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)蛋白的表達水平，探討該藥對乳腺癌組織生長和轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料（1）實驗動物。健康清潔級津白Ⅱ(TAⅡ)近交系雌性小鼠30只，8周齡，體質(zhì)量18.0～21.8 g，購自天津醫(yī)科大學動物實驗中心；小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型（BCML-TAⅡ99）由天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院研究所提供。（2）免疫組織化學試劑。TIMP-1、MMP-9兔抗人、大鼠、小鼠多克隆抗體及二抗，均為工作液，購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及實驗分組運用隨機數(shù)字表進行完全隨機化的分組方法，將小鼠分為對照組和給藥組，各15只。第92代BCML-TAⅡ99瘤株傳代小鼠頸椎離斷處死，無菌條件下取腫瘤組織剪碎至2 mm3，生理鹽水清洗，分別接種于小鼠左側(cè)乳腺區(qū)域。接種結(jié)束后小鼠回籠，每日觀察。于小鼠皮下出現(xiàn)可觸及腫塊后次日開始給藥，對照組每天腹腔注射0.1 mL生理鹽水，給藥組每天腹腔注射鹽酸多西環(huán)素0.1 mL (10 g/L)，共7周。實驗結(jié)束后處死小鼠，完整剖取腫瘤及肺組織稱質(zhì)量并沿最大徑線剖開，于10％福爾馬林常規(guī)固定、石蠟包埋切片。HE染色切片鏡下觀察有無肺轉(zhuǎn)移。

1.2.2 免疫組織化學染色及結(jié)果判定采用免疫組織化學兩步法染色，用PBS代替一抗作為陰性對照，每次染色選擇已知陽性切片作為陽性對照。TIMP-1和MMP-9陽性染色細胞為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片先在低倍鏡（× 100）下觀察整體染色情況，避開壞死區(qū)域選取10個代表區(qū)（即切片的上、下、左、右、中央各2個區(qū)域），高倍鏡（×400）下每區(qū)計數(shù)100個細胞。結(jié)果判定標準：每張切片上計數(shù)1 000個細胞，陽性細胞數(shù)≤5％為陰性，陽性細胞數(shù)＞5％為陽性。個別壞死嚴重的切片不足10個高倍視野按實際視野數(shù)計算。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)分析，計數(shù)資料比較采用Fisher’s確切概率法；相關性分析用Spearman相關；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 多西環(huán)素對小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型肺轉(zhuǎn)移率的影響實驗過程中給藥組小鼠一般狀況較對照組好，實驗結(jié)束后處死小鼠，剖開胸腔，肺組織表面及切面可見白色半透明狀小結(jié)節(jié)，無胸腔積液。HE染色鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)果顯示，給藥組肺轉(zhuǎn)移率均低于對照組，見表1。

Tab.1 Effects of doxycycline on tumor metastasis and the expressions of MMP-9 and TIMP-1表1 多西環(huán)素對轉(zhuǎn)移情況和MMP-9及TIMP-1蛋白表達的影響（n=15）

2.2MMP-9和TIMP-1蛋白表達情況及兩者的相關性MMP-9和TIMP-1陽性為棕黃色顆粒，主要定位于細胞的胞漿內(nèi)，見圖1、2。給藥組MMP-9表達陽性率低于對照組，而TIMP-1表達陽性率高于對照組（均P＜0.05），見表1。MMP-9與TIMP-1的表達呈負相關（r=－0.627，P＜0.01）。

Fig.1 The expression of MMP-9 in breast cancer (Immunohistochemistry,×400）圖1 MMP-9在腫瘤組織表達（免疫組化，×400）

Fig.2 The expression of TIMP-1 in breast cancer (Immunohistochemistry,×400）圖2 TIMP-1在腫瘤組織表達（免疫組化，×400）

3 討論

乳腺癌侵襲性行為受諸多因素的影響，涉及多個步驟，首先腫瘤細胞通過細胞表面受體黏附到ECM層黏蛋白上；其次，蛋白水解酶前體釋放活化，破壞由細胞間質(zhì)及基底膜構成的ECM，主要是對Ⅳ型膠原的水解；最后，腫瘤細胞穿過ECM進入局部淋巴系統(tǒng)及毛細血管，在遠隔部位突破毛細血管形成轉(zhuǎn)移。此過程如果缺乏有效降解Ⅳ型膠原的酶，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程將會終止。郭玉芳等[2]研究表明乳腺癌腫瘤細胞周圍可出現(xiàn)活化的明膠酶（包括MMP-2和MMP-9），而正常乳腺組織中則未見其活化，提示乳腺癌可通過誘導MMPs活化來實現(xiàn)其早期侵襲行為。Lebeau等[3]研究顯示，乳腺癌標本中MMP-9有較高水平表達，且MMPs在乳腺癌腫瘤浸潤的邊緣部位表達增強，與腫瘤侵襲生長的生物型特性相符合。劉玲莉等[4]研究表明MMP-2、MMP-9表達水平與腫瘤的臨床分期、病理類型及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關。

TIMPs是MMPs的天然抑制物，作為MMP-9的天然抑制物，TIMP-1通過與MMP-9形成1∶1的復合物抑制其活性，有研究表明MMPs與TIMPs表達水平失衡與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關[5]。亦有研究顯示多西環(huán)素可以通過調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs表達水平，抑制黑色素瘤的生長[6]。多西環(huán)素屬于化學修飾的四環(huán)素類藥物（CMTs），其特異性的增強抗MMPs作用，減弱抗生素作用，已成為外源性的廣譜MMPs抑制劑，因其長期口服不良反應小，小劑量即可維持較高血藥濃度，如果能在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮一定作用，將有廣泛的臨床應用前景。在體外細胞實驗中，多西環(huán)素能抑制MMP-2、MMP-9的合成及活性[7]。本研究結(jié)果顯示，MMP-9表達于乳腺癌腫瘤細胞胞漿中，且在腫瘤細胞侵襲邊緣密集，而給藥組表達水平相對較低；此外給藥組TIMP-1蛋白表達水平較對照組增高，提示多西環(huán)素可抑制乳腺癌腫瘤組織中MMP-9蛋白的表達，增加TIMP-1的表達。同時，給藥組小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移率低于對照組，提示多西環(huán)素可能通過參與調(diào)解MMP-9/TIMP-1的失衡，實現(xiàn)抑制乳腺癌組織的生長和轉(zhuǎn)移的作用。

[1]Zhou HE,Nothnick WB.The relevancy of the matrix metalloproteinase system to the pathophysiology of endometriosis[J].Front Biosci, 2005,10:569-575．

[2]郭玉芳，梅紅，李一雷，等.DQ明膠原位酶譜分析方法在檢測乳腺癌組織中明膠酶活性的應用[J].中華病理學雜志，2007,36（4）：274.

[3]Lebeau A,Muller-Aufdemkamp C,Allmacher C,et al.Cellular protein and mRNA expression patterns of matix metalloproteinases2,3 and 9 in human breast cancer:correlation with tumor growth[J].J Mol Histol,2004,35(5):443-455.

[4]劉玲莉,朱德茂.乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9表達與其預后的相關性[J].實用癌癥雜志，2010，25（3）：300.

[5]孫淑文，王玉亭，王道奎,等.MMP-2,MMP-9,TIMP-1和Timp-2在膠質(zhì)瘤中的表達及臨床意義[J].濰坊醫(yī)學院學報,2011,33(1)：16-18.

[6]孫保存，張詩武，齊麗莎，等．內(nèi)皮抑素和多西環(huán)素抑制黑色索瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關蛋白表達的研究[J]．中華病理學雜志，2006，35 (11)：677-680．

[7]Shen LC,Chen YK,Lin LM,et al.Anti-invasion and anti-tumor growth effect of doxycycline treatment for human oral squamouscell carcinoma-In vitro and in vivo studies[J].Oral Oncology, 2010,46(3):178-184.

（2013-10-25收稿2014-01-14修回）

（本文編輯李國琪）

Effects of Doxycycline on Tumor Growth and Metastasis in Breast Cancer Xenografts in Mice

ZHAO Yunzhen，LI Jiayi
Tianjin Medical College,Tianjin 300222,China

ObjectiveTo investigate the effects of doxycycline on the expressions of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)and tissue inhibitor of metaloproteinase-1(TIMP-1)in breast cancer lung metastasis model mice(BCML-TAⅡ99),and the mechanism thereof.MethodsThe BCML-TAⅡ99 mouse model was established.The immunohistochemical staining was performed to detect the expressions of MMP-9 and TIMP-1 in BCML-TAⅡ99 model mice and controls．ResultsThe metastasis rate was significantly lower in treatment group than that of control group.The expression of MMP-9 was significantly reduced,but the expression of TIMP-1 was significantly increased,in treatment group compared with those of control group(P＜0.05).ConclusionDoxycycline can inhibit tumor growth and metastasis in breast cancer with 1ung metastasis model mice by regulating MMP-9 and TIMP-1 expressions．

doxycycline;breast neoplasms;neoplasm metastasis;lung;matrix metalloproteinase 9;tissue inhibitor of metalloproteinases;mice,inbred strains;breast cancer

R737.9

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.012

天津市高等學校科技發(fā)展基金計劃項目（20060124）

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