姚衛(wèi)鋒盧桂玲謝艷秋于旺宋蒙蒙李士穎

衣原體噬菌體Vp2蛋白的生物臨床價值分析

姚衛(wèi)鋒1盧桂玲1謝艷秋1于旺1宋蒙蒙1李士穎2△

目的明確衣原體噬菌體Vp2蛋白在病毒重組、篩查研究中的作用，評估Vp2的臨床價值。方法以COBALT程序在線比對各株衣原體噬菌體衣殼蛋白Vp2蛋白序列；并以ProteinBlast的Distance tree功能構(gòu)建種系發(fā)生樹。以高保守區(qū)氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用Gamier-Robson法、Chou-Fasman法分析蛋白二級結(jié)構(gòu)；以Karplus-Schulz法分析柔性區(qū)域；Kyte-Doolittle法、Hopp-Woods法分析親水性；Emini法分析表面可及性；Jameson-Wolf法分析抗原指數(shù)。結(jié)果6株衣原體噬菌體Vp2蛋白序列高度保守，差異主要在Chp1與其他5株噬菌體的Vp2蛋白之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。各株噬菌體的Vp2蛋白均有α螺旋為主的二級結(jié)構(gòu)，蛋白序列高保守區(qū)存在多個細(xì)胞表位。結(jié)論Vp2蛋白性質(zhì)保守，是衣原體噬菌體衣殼的重要組分。其蛋白分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，高保守區(qū)有較強(qiáng)的免疫原性，在病毒重組、沙眼衣原體噬菌體野生株篩查研究中有實際研究價值。

微病毒屬；衣原體科；細(xì)菌噬菌體；蛋白質(zhì)類；計算生物學(xué)

衣原體為胞內(nèi)寄生菌，可經(jīng)眼、呼吸道、泌尿生殖道黏膜感染，易感難治，多年來感染病例仍不斷增加。隨著細(xì)菌噬菌體研究的復(fù)興[1-2]，近年發(fā)現(xiàn)的衣原體噬菌體為衣原體研究開辟了新領(lǐng)域[3]。衣原體噬菌體是一類以衣原體為宿主的病毒[4]。病毒蛋白2（virus protein2，Vp2）是構(gòu)成衣原體噬菌體衣殼的三種結(jié)構(gòu)蛋白之一，核衣殼成熟過程中Vp2參與病毒裝配[5]。本文以衣原體的各株噬菌體Vp2蛋白序列為目標(biāo)，分析Vp2的共同特點(diǎn)，利用獲得的生物信息評估Vp2的潛在研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料各株衣原體噬菌體Vp2蛋白氨基酸序列Gen-Bank序列號分別為Chlamydiaphage1 Vp2（Chp1Vp2，NP_ 044314.1）、Chlamydiaphage2 Vp2（Chp2Vp2，NP_054650.1）、Chlamydiaphage3 Vp2（Chp3Vp2，YP_022482.1）、Chlamydiaphage4 Vp2（Chp4Vp2，YP_338241.1）、Chlamydia pneumoniae phage CPAR39 Vp2（phiCPAR39，NP_063896.1）、Guinea pig Chlamydia phage Vp2（phiCPG1，NP_510874.1）。

1.2 方法以COBALT程序在線比對（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi）各株衣原體噬菌體衣殼蛋白Vp2序列；并以ProteinBlast的Distance tree功能構(gòu)建種系發(fā)生樹。以高保守區(qū)氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用Gamier-Robson 法[6]、Chou-Fasman法[7]分析蛋白二級結(jié)構(gòu)；以Karplus-Schulz法分析柔性區(qū)域；Kyte-Doolittle法[8]、Hopp-Woods法[9]分析親水性；Emini法分析表面可及性；Jameson-Wolf法[9]分析抗原指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 序列高保守區(qū)比對結(jié)果6株衣原體噬菌體Vp2蛋白序列除衣原體噬菌體Chp1的Vp2蛋白由263個氨基酸殘基（a.a）組成外，其他5株的Vp2蛋白都包含186個a.a。比對發(fā)現(xiàn)：Chp1Vp2在N端a.a第1～37（37 a.a），193～213（20 a.a），245～263（18 a.a）節(jié)段與其他5種Vp2蛋白存在長距離“空溝”，見圖1（以短橫線“-”表示），其長度為上述3節(jié)段全長；同時在第125、156、163、239位出現(xiàn)單個a.a長度的比對空溝。分析各株Vp2的種系發(fā)生關(guān)系顯示：Chp1Vp2與其他5株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為單獨(dú)一組；其余5株關(guān)系較近，為一組，同時又分為兩個亞組：phiCPG1和另4株噬菌體，見圖2。以種系發(fā)生關(guān)系為指導(dǎo)，去除Chp1Vp2序列后行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)5株噬菌體的Vp2蛋白無比對空溝，序列構(gòu)成及殘基排列高度一致：以COBALT程序網(wǎng)上比對發(fā)現(xiàn)一致度最低為98％，見圖1。

2.2 保守區(qū)二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果鑒于不同蛋白質(zhì)的氨基酸序列有30％以上的相似性即可認(rèn)為其結(jié)構(gòu)相似[10]，本文以衣原體噬菌體Chp4的Vp2蛋白為代表，分析5株高度相似的衣原體噬菌體（即除去Chp1的其他5株衣原體噬菌體）的Vp2蛋白的二級結(jié)構(gòu)。Chou-Fasman方案和Gamier-Robson方案均示：序列全長范圍頻繁出現(xiàn)長片段α螺旋（Alpha Regions），而β折疊（Beta Regions）結(jié)構(gòu)只有3個，散在分布。轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（Turn Regions）分散排布于上兩者之間，數(shù)量不多。兩種方案顯示的α螺旋位置大部分重合；但β折疊位置有沖突，一致度高的位置為氨基酸殘基N端第25～37區(qū)間。兩方案分析轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)與柔性區(qū)域（Flexible Regions,Karplus-Schulz方法）的位置基本重疊，柔性區(qū)域為N端第5～13、36～ 45、56～63、69～74、82～91、95～102、105～108、115～120、125～132、135～138、140～143、145～150、162～175，占全部氨基酸殘基的43.4％。說明有較多位置存在潛在的細(xì)胞表位。Gamier-Robson方案示：無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（Coil Regions）數(shù)量少而分散，位置上同樣與柔性區(qū)域基本重疊，見圖3。綜合上述：α螺旋位置為N端第3～7、34～57、62～73、77～81、101～104、115～135、144～154、158～165、175～181，為全部氨基酸殘基的47.3％；β折疊位置為N端第26～36，占全部氨基酸殘基的5.3％。說明Vp2蛋白二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主。轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)位置為N端第58～62、84～86、89～94、137～142。

Fig.1 The sequences alignment of six Vp2 proteins圖1 6株衣原體噬菌體的Vp2蛋白序列比對

2.3 B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果Kyte-Doolittle和Hopp-Woods方案分析蛋白親水性顯示親水區(qū)域基本重疊，蛋白親水性較高的區(qū)域（Hydrophilicity Plot）為N端第3～8、35～43、46～50、57～62、84～90、93～100、112～121、125～135、140～153、178～186，見圖3。Jameson-Wolf法預(yù)測抗原指數(shù)（Antigenic Index）較高的區(qū)域為N端第1～8、3～74、83～92、95～105、110～52、157～168、170～177、180～186，見圖3。高抗原指數(shù)區(qū)域與預(yù)測的親水區(qū)重合度良好。Emini方案預(yù)測氨基酸殘基蛋白質(zhì)表面可及性（Surface Probability Plot），顯示N端第5～13、35～46、56～62、68～73、82～91、95～101、105～108、115～119、123～132、134～137、139～142、146～ 150、160～174、180～183區(qū)段表面可及性良好，見圖3。

Fig.2 The phylogenetic tree of six Vp2 protein sequences圖2 6種Vp2種系發(fā)生樹

3 討論

3.1 衣原體噬菌體Vp2蛋白的生物多態(tài)性Vp2蛋白是衣原體噬菌體衣殼蛋白的三種成分之一，與其他兩種蛋白以固定比例構(gòu)成噬菌體的正20面衣殼，是噬菌體包裝成熟過程中不可或缺的蛋白成分。鑒于沒有Vp2相關(guān)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)衍射分析，其三維結(jié)構(gòu)不明。因而本文通過分析Vp2蛋白的一級結(jié)構(gòu)，從理論上反復(fù)論證以獲得Vp2蛋白更多的結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的功能信息。對目前發(fā)現(xiàn)的全部6株噬菌體Vp2蛋白序列的分析，揭示了Vp2蛋白的氨基酸殘基構(gòu)成及排列均有明顯的一致性。雖然出現(xiàn)了3段長距離空溝及4個單殘基長度空溝，比對差異頗為明顯，而這種差異是因為Chp1Vp2序列與其他5株Vp2序列的差異引起的。理論上，蛋白的生物多態(tài)性應(yīng)該更為復(fù)雜，雖然都是衣原體噬菌體的Vp2蛋白，但不同衣原體噬菌體的蛋白必然有其自身特點(diǎn)。而6株Vp2蛋白的種系發(fā)生關(guān)系進(jìn)一步清晰了衣原體噬菌體Chp1株的Vp2蛋白與其他5種Vp2蛋白差異的原因——Chp1Vp2與其他5株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。實際上，上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的第一株衣原體噬菌體Chp1并沒引起關(guān)注[10]。比對其余5種Vp2序列發(fā)現(xiàn)有98％～100％的一致性。比對結(jié)果表明：Vp2蛋白在進(jìn)化過程中高度保守，尤其相對Chp1Vp2的 263個氨基酸殘基，其余五種來自不同衣原體噬菌體的Vp2蛋白的186個氨基酸殘基從組成種類、數(shù)量及排列次序上保守性很高。進(jìn)一步，即使相對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的Chp1Vp2也在序列中包含了這186 a.a（即使相應(yīng)位置的氨基酸殘基不同，但性質(zhì)相似）。這在頻繁發(fā)生突變的簡單微生物種類——病毒中足以引起重視[11]，Vp2蛋白保守性極高，并沒表現(xiàn)出明顯的生物多態(tài)性。因而可以認(rèn)為Vp2在噬菌體組裝成熟過程中有不可替代的功能，以至于其可能的突變（理論上應(yīng)該有較高突變率）將影響噬菌體的生活過程——核衣殼的成熟，這樣可能的突變株不易存活。因此，Vp2蛋白就具備了通用標(biāo)志物的特點(diǎn)，以其為篩查目標(biāo)，將極大提高衣原體噬菌體篩查的靈敏度，這對于在衣原體中，尤其是在沙眼衣原體中尋找噬菌體提供了合理的理論支持。

Fig.3 The prediction map of secondary structure and B cell epitope圖3 二級結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測圖

3.2 衣原體噬菌體Vp2蛋白的二級結(jié)構(gòu)及細(xì)胞表位通過序列比對，發(fā)現(xiàn)的長度為186 a.a蛋白序列仍有必要進(jìn)一步挖掘其生物信息，并從這些信息中獲得研究指導(dǎo)和提示。在晶體結(jié)構(gòu)不明的情況下，應(yīng)用生物信息工具分析其二級結(jié)構(gòu)及細(xì)胞表位的研究方法已經(jīng)為研究者所接受[7-8]：隨著分析工具的不斷完善，多方案分析匯總后的結(jié)果與實證結(jié)構(gòu)的符合率不斷提高?？傇瓌t為：兩種或兩種以上不同原理的預(yù)測方案共同認(rèn)可的預(yù)測結(jié)果將被采信。本文通過不同預(yù)測方案的交叉應(yīng)用，分析了代表高保守186 a.a蛋白序列的Chp4Vp2蛋白序列。研究中普遍認(rèn)為α螺旋、β折疊這兩種結(jié)構(gòu)很少能形成細(xì)胞表位[7-9]，因而在最終結(jié)果分析中剔除上述區(qū)間的預(yù)測表位。反之，對位于無規(guī)卷曲和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)這兩種極可能形成細(xì)胞表位的結(jié)構(gòu)區(qū)的預(yù)測表位，則在預(yù)測中保留，并進(jìn)入下一步評估。進(jìn)一步通過對親水性、表面可及性、抗原指數(shù)指標(biāo)的逐次篩選——滿足高親水性、高表面可及性和高抗原指數(shù)要求后，本研究認(rèn)為氨基酸殘基序列N端第1～6、57～61、83～89、93～99、112～117、181～186區(qū)間為Vp2蛋白的優(yōu)勢B細(xì)胞表位。以這些預(yù)測表位為基礎(chǔ)，將大大簡化后續(xù)核酸、蛋白合成步驟，節(jié)省研究時間及經(jīng)濟(jì)成本。

相對種系發(fā)生晚的流產(chǎn)衣原體、豚鼠結(jié)膜炎衣原體等較新的衣原體都已發(fā)現(xiàn)了自身的噬菌體，從進(jìn)化角度推測，種系發(fā)生較早的沙眼衣原體也是臨床關(guān)注度最高的衣原體，很可能存在自己的噬菌體。目前發(fā)現(xiàn)的總計6株衣原體噬菌體各以一種或幾種衣原體為宿主，并且噬菌體宿主譜間有交叉重疊[10]。這表明可以從沙眼衣原體之外的其他衣原體中尋找能感染沙眼衣原體的噬菌體。以上兩方面都需要以目前發(fā)現(xiàn)的衣原體噬菌體為基礎(chǔ)，通過其某種共性來尋找新的衣原體噬菌體。Vp2蛋白的高保守性、多優(yōu)勢表位的可選擇性順應(yīng)了這個要求，因而是很好的標(biāo)志蛋白。

本文分析了全部6株衣原體噬菌體的Vp2蛋白氨基酸序列，證明各株噬菌體的Vp2蛋白一致度很高，性質(zhì)保守。序列的高保守區(qū)中有6個優(yōu)勢B細(xì)胞表位并獲得各個表位的具體位置及氨基酸構(gòu)成信息。明確了該蛋白在病毒重組、沙眼衣原體噬菌體野生株篩查研究中有重要價值。6株衣原體噬菌體中的5株是近10余年發(fā)現(xiàn)的，該領(lǐng)域研究亟待拓展，并由此推進(jìn)衣原體疾病的基礎(chǔ)研究。

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（2013-11-25收稿2013-12-30修回）

（本文編輯李鵬）

The Clinical Value of Chlamydia Phage Vp2 Protein

YAO Weifeng1，LU Guiling1，XIE Yanqiu1，YU Wang1，SONG Mengmeng1，LI Shiying2
1 Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital,Tianjin 300120，China；2 Tianjin Gongan Hospital LI Shiying，E-mail:lishiyingmed@sohu.com

ObjectiveTo evaluate the effect of chlamydiaphage virus protein 2(Vp2)on the recombinant virus and virus screening research,and it clinical value thereof.MethodsTo compare the Vp2 protein sequences to get the conservative region with COBALT.A phylogenetic tree was built with ProteinBlast of Distance tree.The amino acid sequence in the high conservative region was predicted by the methods of Gamier-Robson and Chou-Fasman,and its flexibe regions were predicted by Karplus method.The hydrophilicity plot was predicted by Kyte-Doolittle and Hopp-Woods method.The surface probability was analysed by Emini,and the antigenic index was analysed by Jameson-Wolf method.ResultsThe six Chlamydiaphage Vp2 proteins were the highly conserved sequences.There were obvious differences between Chp1Vp2 and other 5 Vp2 proteins.There were the main structure-alpha helix and some cell epitopes in the high conserved region.ConclusionVp2 protein is the important component of chlamydia phage capsid with the conservative nature.Vp2 protein has complicated structures and high conservative region with strong immunogenicity,playing a practical value of research in virus recombinantment and screening the wild strains of chlaymdia trachomatis phage.

microvirus；chlamydiaceae；bacteriophages；proteins；computational biology

R373.9

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.003

天津市中醫(yī)藥管理局科技基金資助項目（13017）

1天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院（郵編300120）；2天津市公安醫(yī)院

△通訊作者E-mail:lishiyingmed@sohu.com