張慧　陳莉　趙思峰

摘要：利用同源重組基因敲除方法構(gòu)建了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S44 ituD基因同源突變株。菌落PCR、RT-PCR、SDS-PAGE結(jié)果均顯示ituD基因缺失突變株構(gòu)建成功。野生株與突變株的菌落形態(tài)、生長速率以及抑菌活性均有顯著差異。抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變株抑菌活性顯著減弱，成功構(gòu)建的ituD基因突變株為進(jìn)一步研究ituD基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；ituD基因；敲除突變株；抑菌活性

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）06-1436-04

Construction of the ituD Gene Knockout Mutant of Bacillus subtilis S44

ZHANG Hui，CHEN Li，ZHAO Si-feng

（Key Laboratory of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricultural Pest Management and Utilization of Plant Protection Resource/College of Agriculture， Shihezi University， Shihezi 832003， Xinjiang，China）

Abstract： To approach the relationship between the ituD gene and the antifungal activity of Bacillus subtilis S44， an isogenic knockout mutant of ituD gene was generated based on the principle of homologous recombination and confirmed by PCR， reverse transcription polymerase chain reaction and SDS-PAGE. The resulting mutant strain exhibited growth kinetics different from those of the WT parent strain upon cultivation in standard laboratory used in our in vitro assays. The morphology， growth rate and antifungal activity of wild type and mutant colony were significantly different. Antifungal activity results showed antifungal activity mutants were significantly reduced. The ituD mutant was successfully constructed for further study on ituD gene biological function basis.

Key words： Bacillus subtilis； ituD gene； knockout mutant； antifungal activity

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可產(chǎn)生抗菌脂肽、水解酶等多種胞外代謝物，致使植物病原菌菌絲畸形、原生質(zhì)濃縮、抑制孢子萌發(fā)以及菌絲端破裂，這是其防治植物病害的主要機(jī)理之一[1，2]。由非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素是其中最常見的一類，主要包括iturin、surfactin和fengycin 3個(gè)家族[3]。iturin家族中的iturin A對(duì)多種植物病原真菌有很強(qiáng)的抑菌活性，同時(shí)抑菌譜非常廣，已被公認(rèn)為是一種理想的可生物合成的殺菌劑[4]，同時(shí)因其抑菌譜廣、對(duì)哺乳動(dòng)物低毒和低致敏性，在人和動(dòng)物藥物開發(fā)方面也表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[5]。iturin A操縱子由ituD、ituA、ituB和ituC 4個(gè)開放閱讀框組成，其中ituD基因編碼丙二酰CoA轉(zhuǎn)移酶，該基因的缺失將導(dǎo)致iturin A產(chǎn)生的缺乏[6]，通過同源重組構(gòu)建枯草芽孢桿菌UMAF6639 ituD基因缺失的突變株，發(fā)現(xiàn)該突變株沒有產(chǎn)生iturin A的能力[7]。本研究中所用枯草芽孢桿菌S44是從新疆維吾爾自治區(qū)棉田根際土壤中分離獲得，對(duì)多種植物病原菌具有很強(qiáng)抑制作用，對(duì)棉花黃萎病[8]、棉苗爛根病[9]以及加工番茄土傳病害[10]均表現(xiàn)出了良好的防病效果，同時(shí)已從該菌株中克隆到了與iturin A合成密切相關(guān)的ituD基因[11]。本研究采用同源重組基因敲除方法構(gòu)建了ituD基因缺失株，建立了枯草芽孢桿菌基因缺失株的構(gòu)建方法，為進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌抑菌機(jī)理和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 枯草芽孢桿菌S44分離自新疆維吾爾自治區(qū)棉田土壤中；立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）分離自棉花立枯病病樣；大腸桿菌（E.coli）DH5α，質(zhì)粒pBR322，pUC18，pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 DNA限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶、T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；TransZol Up試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購自Invitrogen公司；Gene Pulser Xcell TM型電穿孔儀及電轉(zhuǎn)杯為Bio-Rad公司產(chǎn)品。引物合成和基因測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 ituD基因的克隆與測(cè)序 根據(jù)已報(bào)道的枯草芽孢桿菌ituD基因特異性引物[12]，并分別在上、下游引物中加入BamHⅠ和SphⅠ位點(diǎn)，引物序列見表1。以枯草芽孢桿菌S44 基因組DNA為模板，用引物ituD-F/R經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小約為1.2 kb的DNA片段，回收DNA片段并連接于pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素的麥康凱平板上培養(yǎng)，挑取陽性克隆菌落，PCR鑒定為陽性的克隆由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，得到重組質(zhì)粒pMD18-T-ituD。

1.2.2 tet標(biāo)記基因的克隆與測(cè)序 參照文獻(xiàn)[13]，以質(zhì)粒pBR322為模板，用引物T-up、T-down擴(kuò)增tet基因，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增出1.3 kb的片段，回收DNA片段并連接于pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素的麥康凱平板上培養(yǎng)，挑取陽性克隆菌落，PCR鑒定為陽性的克隆由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 敲除質(zhì)粒pUC18-ituD：：tet的構(gòu)建 分別用BamHⅠ和Sph I雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-ituD和pUC18，分別獲得1 200 bp和2 500 bp的線性片段。將酶切片段連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α后，進(jìn)行紅白斑篩選。重組克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序，得到重組質(zhì)粒pUC18-ituD。再分別用ClaⅠ酶切pMD18-T-tet和pUC18-ituD，將酶切下來的抗性基因tet與酶切的pUC18-ituD質(zhì)粒進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)酶切驗(yàn)證得到敲除質(zhì)粒pUC18-ituD：：tet。

1.2.4 突變株的篩選與鑒定 參照陸雁等[14]的方法制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在1.8 kV/cm、600 Ω和25 μF電轉(zhuǎn)參數(shù)下，將構(gòu)建好的敲除載體pUC18-ituD：：tet轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌S44感受態(tài)細(xì)胞，將電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含四環(huán)素（5 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)16～24 h后，以單菌落為模板，以ituD-F/R為引物進(jìn)行PCR初步篩選。

1）突變株的DNA測(cè)序鑒定。為了驗(yàn)證ituD基因是否插入tet基因，用引物ituD-F和ituD-R對(duì)突變株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)對(duì)ituD-F/R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體中，挑取陽性克隆菌落，PCR鑒定為陽性的克隆送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

2）RT-PCR鑒定。將野生株和突變株接種于NA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，用TransZol Up試劑提取總RNA，以此為模板合成cDNA 第一鏈，并利用ituD基因引物ituD-F/R對(duì)cDNA進(jìn)行PCR鑒定。

3）SDS-PAGE鑒定。制備野生株和突變株的全菌蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳。

1.2.5 突變株的生物學(xué)特性

1）生長速率比較。分別挑取野生株和突變株的單菌落接種于NA培養(yǎng)基，30 ℃過夜培養(yǎng)后，按3∶100（體積比）轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基中，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 h測(cè)定菌液的 OD600 nm，直至細(xì)菌生長處于穩(wěn)定期，繪制生長曲線，同時(shí)觀察細(xì)菌的菌落形態(tài)。

2）抑菌活性檢測(cè)。分別取培養(yǎng)50 h的野生株和突變株菌液，12 000 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm的過濾器過濾，以立枯絲核菌作為檢測(cè)菌株，分別對(duì)野生株和突變株抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體pUC18-ituD：：tet的鑒定

提取質(zhì)粒pUC18-ituD：：tet進(jìn)行酶切與雙酶切驗(yàn)證（圖1），用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SphⅠ、SphⅠ、ClaⅠ和BamHⅠ酶切pUC18-ituD：：tet后，分別獲得大小約為2.5、2.0、1.3、1.2和1.1 kb的DNA片段，條帶均與預(yù)期大小相符，DNA測(cè)序結(jié)果也顯示DNA片段序列及連接順序正確。

2.2 突變株S1的篩選與鑒定

將提取的質(zhì)粒pUC18-ituD：：tet通過電轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入枯草芽孢桿菌S44感受態(tài)細(xì)胞，在含有5 μg/mL四環(huán)素的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，這些轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生于兩種轉(zhuǎn)化途徑， 即同源重組和非同源重組，為了進(jìn)一步鑒定重組為發(fā)生在ituD基因位點(diǎn)的雙交換重組，即抗性基因tet片段正確插入到ituD基因之中，提取轉(zhuǎn)化子的染色體DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)。如果在ituD位點(diǎn)沒有發(fā)生雙交換重組，PCR產(chǎn)物大小應(yīng)該在1.2 kb。如果ituD基因位點(diǎn)發(fā)生了雙交換重組，tet片段通過交換插入到ituD基因中，則PCR產(chǎn)物大小應(yīng)該在2.5 kb左右。

對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有枯草芽孢桿菌S1擴(kuò)增到約2.5 kb的特異片段（圖2），其他轉(zhuǎn)化子無特異性條帶，結(jié)果初步表明枯草芽孢桿菌S1為ituD基因缺失突變株。

2.2.1 突變株S1 DNA測(cè)序鑒定 為從核苷酸序列水平進(jìn)一步證明突變株S1確實(shí)發(fā)生了ituD基因的缺失，以突變株S1的染色體DNA為模板擴(kuò)增出約2.5 kb的特異性片段用膠試劑盒回收，然后連接入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)和測(cè)序，序列測(cè)定結(jié)果與預(yù)期完全一致。

2.2.2 RT-PCR驗(yàn)證 利用TransZol Up試劑提取細(xì)菌野生株S44和突變株S1的總RNA。用引物ituD-F/R分別對(duì)野生株S44和突變株S1反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，野生株S44中PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明ituD基因正常轉(zhuǎn)錄，而在突變株S1中為陰性，從轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)ituD基因的缺失（圖3）。

2.2.3 SDS-PAGE驗(yàn)證 如果ituD基因被敲除后，突變株S1不能表達(dá)ituD蛋白質(zhì)，而該蛋白質(zhì)在野生株S44均能正常表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，在野生株S44全菌蛋白質(zhì)中能觀察到分子質(zhì)量45 ku的蛋白質(zhì)條帶，而在突變株S1的全菌蛋白中沒有觀察到該蛋白質(zhì)（圖4）。

2.3 突變株S1的生長速率

將野生株S44和突變株S1接種于LB平板培養(yǎng) 24 h后，可見突變株S1長出為淡灰白色、圓形、邊緣整齊、表面光滑的菌落，而野生菌株S44菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色；突變株S1的菌落直徑較野生株小。由圖5可知，野生株S44對(duì)數(shù)生長期生長速度較突變株S1遲緩，在生長前期，突變株S1生長快于野生株S44，后期野生株S44快于突變株S1，且野生株S44的OD600 nm大于突變株S1。

2.4 突變株S1抑菌活性的影響

將ituD基因缺失株在PDA平板上進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)（圖6），以野生株S44作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)ituD基因缺失株沒有抑菌活性，驗(yàn)證了ituD基因與抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)。

3 小結(jié)與討論

本研究為探討ituD基因的功能，構(gòu)建了一個(gè)含tet基因的兩側(cè)具有與ituD基因同源序列的同源敲除載體pUC18-ituD：：tet，通過敲除載體和枯草芽孢桿菌S44株基因組DNA之間的同源重組獲得了缺失ituD基因的突變株S1，并通過PCR、RT-PCR和SDS-PAGE對(duì)敲除株在基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上進(jìn)行了鑒定，結(jié)果證實(shí)突變株構(gòu)建成功。獲得敲除突變株后通過生物學(xué)功能試驗(yàn)比較了野生株S44和突變株S1在生長速率、菌落形態(tài)和抑菌活性等方面的差異。生長曲線結(jié)果顯示，與野生株S44相比，突變株S1對(duì)數(shù)生長前期速率較快，后期明顯慢于野生株。菌落形態(tài)觀察顯示，與野生株S44相比突變株S1在LB平板上長出表面光滑的小菌落。抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生株S44相比突變株S1對(duì)立枯絲核菌的抑菌活性相對(duì)較弱，幾乎沒有抑菌活性。本研究對(duì)ituD基因的敲除不僅進(jìn)一步驗(yàn)證了ituD基因在iturin A合成中的功能，同時(shí)也建立了枯草芽孢桿菌功能基因缺失株的構(gòu)建方法，為枯草芽孢桿菌S44中其他基因的敲除及功能研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)， 對(duì)于開展枯草芽孢桿菌蛋白組研究也具有非常重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

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2.3 突變株S1的生長速率

將野生株S44和突變株S1接種于LB平板培養(yǎng) 24 h后，可見突變株S1長出為淡灰白色、圓形、邊緣整齊、表面光滑的菌落，而野生菌株S44菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色；突變株S1的菌落直徑較野生株小。由圖5可知，野生株S44對(duì)數(shù)生長期生長速度較突變株S1遲緩，在生長前期，突變株S1生長快于野生株S44，后期野生株S44快于突變株S1，且野生株S44的OD600 nm大于突變株S1。

2.4 突變株S1抑菌活性的影響

將ituD基因缺失株在PDA平板上進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)（圖6），以野生株S44作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)ituD基因缺失株沒有抑菌活性，驗(yàn)證了ituD基因與抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)。

3 小結(jié)與討論

本研究為探討ituD基因的功能，構(gòu)建了一個(gè)含tet基因的兩側(cè)具有與ituD基因同源序列的同源敲除載體pUC18-ituD：：tet，通過敲除載體和枯草芽孢桿菌S44株基因組DNA之間的同源重組獲得了缺失ituD基因的突變株S1，并通過PCR、RT-PCR和SDS-PAGE對(duì)敲除株在基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上進(jìn)行了鑒定，結(jié)果證實(shí)突變株構(gòu)建成功。獲得敲除突變株后通過生物學(xué)功能試驗(yàn)比較了野生株S44和突變株S1在生長速率、菌落形態(tài)和抑菌活性等方面的差異。生長曲線結(jié)果顯示，與野生株S44相比，突變株S1對(duì)數(shù)生長前期速率較快，后期明顯慢于野生株。菌落形態(tài)觀察顯示，與野生株S44相比突變株S1在LB平板上長出表面光滑的小菌落。抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生株S44相比突變株S1對(duì)立枯絲核菌的抑菌活性相對(duì)較弱，幾乎沒有抑菌活性。本研究對(duì)ituD基因的敲除不僅進(jìn)一步驗(yàn)證了ituD基因在iturin A合成中的功能，同時(shí)也建立了枯草芽孢桿菌功能基因缺失株的構(gòu)建方法，為枯草芽孢桿菌S44中其他基因的敲除及功能研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)， 對(duì)于開展枯草芽孢桿菌蛋白組研究也具有非常重要的意義。

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2.3 突變株S1的生長速率

將野生株S44和突變株S1接種于LB平板培養(yǎng) 24 h后，可見突變株S1長出為淡灰白色、圓形、邊緣整齊、表面光滑的菌落，而野生菌株S44菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色；突變株S1的菌落直徑較野生株小。由圖5可知，野生株S44對(duì)數(shù)生長期生長速度較突變株S1遲緩，在生長前期，突變株S1生長快于野生株S44，后期野生株S44快于突變株S1，且野生株S44的OD600 nm大于突變株S1。

2.4 突變株S1抑菌活性的影響

將ituD基因缺失株在PDA平板上進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)（圖6），以野生株S44作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)ituD基因缺失株沒有抑菌活性，驗(yàn)證了ituD基因與抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)。

3 小結(jié)與討論

本研究為探討ituD基因的功能，構(gòu)建了一個(gè)含tet基因的兩側(cè)具有與ituD基因同源序列的同源敲除載體pUC18-ituD：：tet，通過敲除載體和枯草芽孢桿菌S44株基因組DNA之間的同源重組獲得了缺失ituD基因的突變株S1，并通過PCR、RT-PCR和SDS-PAGE對(duì)敲除株在基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上進(jìn)行了鑒定，結(jié)果證實(shí)突變株構(gòu)建成功。獲得敲除突變株后通過生物學(xué)功能試驗(yàn)比較了野生株S44和突變株S1在生長速率、菌落形態(tài)和抑菌活性等方面的差異。生長曲線結(jié)果顯示，與野生株S44相比，突變株S1對(duì)數(shù)生長前期速率較快，后期明顯慢于野生株。菌落形態(tài)觀察顯示，與野生株S44相比突變株S1在LB平板上長出表面光滑的小菌落。抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生株S44相比突變株S1對(duì)立枯絲核菌的抑菌活性相對(duì)較弱，幾乎沒有抑菌活性。本研究對(duì)ituD基因的敲除不僅進(jìn)一步驗(yàn)證了ituD基因在iturin A合成中的功能，同時(shí)也建立了枯草芽孢桿菌功能基因缺失株的構(gòu)建方法，為枯草芽孢桿菌S44中其他基因的敲除及功能研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)， 對(duì)于開展枯草芽孢桿菌蛋白組研究也具有非常重要的意義。

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